辛伐他汀聯合利塞膦酸鈉對尾懸吊誘導小鼠骨丟失的作用

范新昊，田發明，王婧瑤，張 楠，遲博婧，張國彬*，郭志斌

(1.開灤總醫院，河北 唐山 063000；2.華北理工大學，河北 唐山 063000；3.開灤總醫院林西礦醫院，河北 唐山 063000)

一定的負荷刺激對于維持骨穩態和骨骼健康至關重要，適當應力刺激如體育鍛煉可促進骨形成[1]，而失用造成的負荷刺激缺失往往會造成肌肉萎縮和骨量丟失，研究表明，長期臥床、癱瘓或航天飛行導致每月1%～2%的骨量丟失[2]。目前對于該類骨丟失的治療仍以二磷酸鹽類藥物為主，可以通過抑制骨吸收降低骨轉換率部分抑制宇航員骨量下降，但該類藥物對促進骨形成的作用有限[3]。如果在干預方案中考慮抑制骨吸收與促進骨形成藥物聯合應用，可能療效會優于單純抑制骨吸收，也更適用于防治失用導致的骨丟失。

辛伐他汀是目前一線降血脂藥物，其成骨作用潛能近年來備受關注。課題組前期研究證實辛伐他汀單純體內干預雖表現出一定的骨保護作用[4]，但僅對大鼠股骨近端的骨丟失有抑制作用，如果聯合應用骨吸收抑制劑如利塞膦酸鈉，能否取得更好效果，尚有待進一步研究證實。基于以往研究，不同性質的骨代謝調節劑聯合應用有可能取得更好的抗骨質疏松的作用[5]，我們推測辛伐他汀與利塞膦酸鈉聯合應用可以抑制失用性骨丟失，并較單獨用藥具有更好的效果。本研究 擬通過尾懸吊法建立小鼠失用性骨丟失模型，并給予辛伐他汀和或利塞膦酸鈉干預，觀察單獨用藥與聯合用藥的干預效果，以期為進一步探索相關干預方案和作用機制等后續研究乃至相關臨床干預提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究應用SPF級12周齡雄性C57BL/6小鼠30只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京)2017-0001]，體重(25±3)g，所有小鼠在華北理工大學動物中心屏障環境中飼養[SYXK (冀)2015-0038]。本研究中涉及實驗動物的處理和干預，均符合華北理工大學實驗動物倫理委員會的相關規定，動物實驗倫理審查證明編號為：LX201809，并遵照實驗動物使用的3R(減少、替代、優化)原則給予人道關懷。制備模型與處死時應用小動物多功能麻醉機進行誘導麻醉，麻醉藥物為異氟烷，氣體流量500 mL/min，濃度1.5%，處死時與其他動物隔離。

1.2 主要試劑與儀器

異氟烷(深圳市銳沃德生命科技有限公司)；利塞膦酸鈉(北京雙鷺藥業股份有限公司)；辛伐他汀(浙江瑞邦藥業有限公司生產)；TRIzol(Invitrogen，美國)；TaKaRa逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(大連寶生物有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京建成生物技術有限公司)；小鼠OPG(美國Abcam公司)、RANKL抗體(美國Santa Cruz公司)、山羊抗兔二抗(美國SAB公司)。微計算機斷層掃描(micro-CT，Skyscan，比利時)；AG-IS型萬能試驗機統(日本島津公司)；PCR儀(Applied biosystems美國)；小動物多功能麻醉機(ZS-MV-I，北京眾實迪創科技發展有限責任公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及處理

所有小鼠隨機分成5組，每組6只：對照組(A組)、模型組(B組)、辛伐他汀組(C組)、利塞膦酸鈉組(D組)和聯合干預組(E組)。除A組外，其余各組小鼠均采用尾部懸吊(軀體與地面呈40°左右角度，以后肢伸直不能著地為準)制備尾懸吊擬失重模型，分別給予生理鹽水(B組)，辛伐他汀(5 mg/(kg·d)，C組)、利塞膦酸鈉(1 mg/(kg·d)，D組)和兩者聯合(E組)灌胃干預，3周后異氟烷麻醉處死取材。實驗結束時各組均無小鼠死亡，所有動物納入最終指標分析和結果統計。

1.3.2 Micro-CT分析

應用Sky Scan 1076 Micro-CT 對小鼠左側脛骨進行掃描檢測，收集數據，并利用Micro-CT 配套軟件對掃描圖像進行三維重建及結果分析。脛骨近端松質骨興趣區為上端生長板下0.5～2 mm，皮質骨內側的松質骨；脛骨中段皮質骨感興趣區為脛腓骨連接處上方1 mm。松質骨檢測指標有: 骨容積率(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、結構模型指數(Structure Model Index, SMI)。皮質骨檢測指標BV /TV、皮質骨厚度(Cortical bone thickness，Ct.Th)。

1.3.3 生物力學檢測

取所有小鼠的右側股骨行生物力學分析，采用三點彎曲試驗，支點跨距(L)為6 mm，中央垂直(股骨與載荷成90°角)加載負荷，速率5 mm/min，直至股骨斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。

1.3.4 聚合酶鏈反應

實驗結束后提取小鼠右側脛骨，制備組織勻漿，采用TRIzol法提取總RNA，應用TaKaRa試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，實時熒光光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測OPG和RANKL的表達。配制反應液：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.8 μL Forward Primer，0.8 μL Reverse Primer，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，2 μL cDNA，6 μL滅菌水，總體系為20 μL；Real-time PCR反應條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 34 s，共40個循環；記錄各標本擴增的Ct值，以2-ΔΔCt作為統計數值，檢測各基因與內參基因GAPDH的比值，得出目的基因表達的相對含量，公式如下：ΔΔCt=Ct處理組(目的基因-內參基因)-Ct對照組(目的基因-內參基因)。引物序列OPG 上游5’-TTTCTTCTGGGCTGATCTTCTTCC-3’，下游5’-CATCCAAGACATTGACCTCTCTTGA-3’；RANKL 上游5’-CTGATGAAAGGAGGGAGCACG-3’，下游 5’-GGAAGGGTTGGACACCTGAATG-3’；GAPDH 上游5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3’，下游5’-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTT-3’。

1.3.5 Western blot

實驗結束后，提取各組小鼠右側股骨總蛋白，采用BCA定量蛋白，根據測定蛋白濃度計算上樣量，經電泳及轉膜后，取出PVDF膜置于TBST配制的5%脫脂奶粉中孵育、漂洗2 h，完成對非特異性抗原的封閉。封閉結束后將膜與OPG抗體(1∶200)或RANKL(1∶200)抗體孵育，4℃過夜。次日加入IgG二抗稀釋液(1∶1000)中，37℃搖床孵育2 h，然后置于TBST緩沖液搖床漂洗，控干TBST后，用ECL顯色液顯色，待蛋白條帶清晰后立刻取出PVDF膜，置于清水中終止顯色。采用Image J軟件進行圖像灰度掃描測定，測定目的蛋白OPG、RANKL與內參蛋白β-actin的OD值，計算兩者比值作為其相對表達量，進行統計分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 Micro-CT檢測結果

各組小鼠脛骨中段皮質骨及脛骨近端松質骨的micro-CT三位重建圖如圖1所示。相關參數的數據分析結果如下：皮質骨：骨容積率比較，B、C、D、E組均顯著低于A組(P<0.05)；E組顯著高于B、C、D組(P<0.05)，其余組間比較無顯著差別(P>0.05)。皮質骨厚度，B、C組顯著低于A組(P<0.05)，E組顯著高于B、C組(P<0.05)，其余組間比較沒有顯著差異(P>0.05)。見表1。

脛骨近端松質骨分析結果：骨容積率：B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)；C、D組顯著高于B組(P<0.05)，E組顯著高于B、C、D組(P<0.05)；骨小梁數量：B、C、D組顯著低于A、E組(P<0.05)；骨小梁厚度：B組顯著低于A組(P<0.05)，C、D、E組顯著高于B組(P<0.05)；骨小梁分離度B、C、D組顯著高于A、E組(P<0.05)；結構模型指數B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)。見表2。

2.2 生物力學

最大載荷：B、C、D、E組顯著低于A組(P<0.05)，E組顯著高于B組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較無顯著差別(P<0.05)；彈性模量：B、C、D組顯著低于A組(P<0.05)，B、E組顯著高于B組(P<0.05)，其余各組間兩兩比較無顯著差別(P<0.05)。見表3。

圖1 小鼠脛骨micro-CT三維重建圖

Table1Results of micro-CT of cortical bone in the middle shaft of the tibia

指標Indices對照組(A組)Control group(group A)模型組(B組)Tail suspension group(group B)辛伐他汀組(C組)Simvastatin treatmentgroup (group C)利塞膦酸鈉組(D組)Risedronate sodiumtreatment group (group D)聯合治療組(E組)combined treatmentgroup (group E)骨容積率(%)BV/TV0.69±0.020.61±0.02a0.63±0.03a0.63±0.02a0.66±0.03abcd皮質骨厚度(μm)Ct.Th230.3±11213.7±10.5a214.8±8.5a225.1±14.8231±13.1bc

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

表2 脛骨近端松質骨micro-CT分析結果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.Compared with the group C,cP<0.05.Compared with the group D,dP<0.05.

2.3 PCR檢測結果

實時熒光定量PCR分析結果顯示，OPG的mRNA表達在C、E組顯著高于B組(P<0.05)，其余組間比較未見顯著差異(P<0.05)；RNAKL在B組表達顯著高于A組(P<0.05)，其余組間比較未見顯著差異(P<0.05)。見表4。

2.4 Western blot檢測結果

Western blot分析OPG、RANKL蛋白表達結果顯示：OPG在A組的表達顯著高于其余各組(P<0.05)，E組顯著高于B組(P<0.05)；RANKL在A組的表達顯著低于其余各組(P<0.05)。如圖2所示。

3 討論

失用性骨質疏松在臨床中多見于長期臥床的患者，骨量丟失、肌肉力量減弱和協調性下降會增加骨折風險。而一旦發生骨折，往往對患者乃至其家庭帶來沉重打擊，目前對于失用性骨質疏松的重視程度仍亟待提高，其有效防治方案也在積極探索中。通過對小鼠尾部懸吊離地，導致后肢應力缺失是目前常用的模擬失用性骨質疏松的動物模型[6-7]。本研究經過三周尾懸吊成功制備了該小鼠模型，Micro-CT分析發現該模型小鼠骨量下降，微結構退變，蛋白水平RANKL表達水平上調，OPG水平下調，提示該模型同時伴有骨形成下降和骨吸收活性增強，這也與部分研究結果一致[8-9]，由于失重導致的骨細胞凋亡分泌更多的RANKL是該模型骨吸收活躍并導致骨丟失的重要機制[9]。

表3 生物力學檢測結果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

表4 PCR檢測結果

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

Note.Compared with the group A,aP<0.05.Compared with the group B,bP<0.05.

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

他汀類藥物，尤其是水溶性他汀類藥物，除了降脂外，其他潛在作用也日益收到關注，其促進骨形成潛能目前已初步得到認可[10-12]，課題組在前期研究中發現辛伐他汀可部分阻止尾懸吊大鼠股骨近端骨丟失，但未能達到正常對照組水平，本研究中我們發現，辛伐他汀作用3周可部分組織小鼠脛骨近端松質骨的骨丟失，但對脛骨中段皮質骨丟失的抑制作用并不顯著。但是mRNA水平對OPG和RANKL的分析發現，辛伐他汀可有效促進OPG在mRNA水平的表達，但進一步分析發現對蛋白水平的表達影響并不顯著。鑒于蛋白水平不僅僅取決于生產效率及mRNA翻譯過程，也同樣收到降解相關因素的影響，因此雖然我們在該單一節點提取的蛋白表達水平為觀測到顯著差異，但mRNA表達水平的升高也初步提示了辛伐他汀的促進骨形成作用。辛伐他汀對OPGmRNA表達的促進作用和對RANKLmRNA抑制作用在以往研究中均有報道[13-14]。

利塞膦酸鈉作為第三代二磷酸鹽類藥物[15-17]，是目前一線應用的抗股指數松藥物之一，但主要應用于絕經后骨質疏松癥，對于失用性骨質疏松的干預效果報道較少。本研究發現，利塞膦酸鈉可以部分阻止該模型松質骨和皮質骨骨量丟失，較之辛伐他汀，對于維持皮質骨厚度的作用更為顯著。但生物力學進一步分析發現，兩者單獨干預均未能表現出顯著效果，利塞膦酸鈉對該模型小鼠組織學水平的影響并無顯著優勢。有研究比較了聯合阿侖膦酸鹽和辛伐他汀或單獨用藥對高脂飲食卵巢切除大鼠的抗骨質疏松和抗動脈粥樣硬化作用，結果發現阿侖膦酸鈉和辛伐他汀聯合應用具有抗骨質疏松、抗血脂異常和抗動脈粥樣硬化的作用[18]。本研究中，與單獨用藥相比，多項檢測均支持兩者聯合應用效果更好，部分指標包括微觀結構參數和彈性模量等與正常對照組無顯著差別，且均優于單獨用藥組，OPG和RANKL蛋白水平的分析亦發現，聯合用藥促進OPG表達的作用更顯著。在一項糖皮質激素誘發的大鼠骨質疏松模型的研究中中，雖然利塞膦酸鈉表現出一定的保護骨質量的作用，但合并辛伐他汀干預較單純利塞膦酸鈉表現出更好的效果[19]。

然而，不同性質藥物合并使用并非能取得疊加或協同效應，比如與單獨使用利塞膦酸鈉相比，維生素K2與利塞膦酸鈉合并使用并不能顯著降低骨質疏松患者骨折發生風險[20]。因此，本研究采用的干預方案對該類骨質疏松的干預效果尚有待更多的研究證實和探討。此外，本研究存在一定的局限性。首先，兩種藥物選擇單一劑量，并未探討不同劑量配比的作用效果，不排除更佳藥物劑量的聯合應用方案。此外，本研究并未探討聯合用藥方案對不同月齡大鼠模型的干預效果，且尾懸吊法不能完全模擬人類失用性骨質疏松。因此，干預方案的單一和動物模型的選擇是本研究的主要局限，后續仍需更多研究深入探討。