玉屏風散與超微粉中毛蕊異黃酮 葡萄糖苷體外溶出率的研究

馬霞，周延州，郭振環，趙麗，劉永錄*，王林，張國祖

(1.河南牧業經濟學院，鄭州 450046；2.河南省康星生物科技有限公司，河南焦作 454950； 3.河南省康星藥業股份有限公司，鄭州451464)

玉屏風散是元代醫學家危亦林所創的名方，主要由黃芪、白術(炒)、防風以3∶1∶1的比例制成，該藥具有益氣固表，滋陰清熱的功效，獸醫臨床上常用于提高畜禽生長性能，增強機體非特異性免疫力[1-3]。超微粉碎可以將植物的細胞壁破碎，增加有效成分溶出，提高生物利用度，從而降低用藥成本，達到最好的用藥效果[4-5]。玉屏風超微粉就是將玉屏風散通過超微粉碎技術得到的新劑型。

為考察玉屏風散經過超微粉碎后有效成分的溶出情況，實驗以黃芪中有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷為標示成分進行研究。首先建立玉屏風超微粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量檢測方法，為達到模擬動物機體胃環境的目的，試驗選用人工胃液為溶出介質，采用漿法測定玉屏風超微粉和散劑中標示成分的溶出率，從而為玉屏風超微粉的臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀(型號P230，大連伊力特公司，配制紫外檢測器)；藥物溶出儀(型號RCZ-1A，上海黃海藥檢儀器有限公司)；萬分之一電子天平(型號AUW220D1，島津國際貿易有限公司)；超聲波清洗器(型號KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(含量97.9%中國食品藥品檢定研究院，批號11920-201102)；玉屏風散(批號20180403)、玉屏風超微粉(批號為20180403的玉屏風散超微粉碎，按企業內控標準采用激光粒度分析儀檢測小于48 μm的粒度百分比為95%)均由河南省康星藥業股份有限公司研發中心制備提供；純化水(Minipore 純水器制備)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、鹽酸等為分析純，均購自天津市四友精細化學品有限公司。

1.2 HPLC檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.2%甲酸(35∶65)；柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長為260 nm。理論板數按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計算應不低于3000。

1.2.2 對照品溶液的配制[6]精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，放入容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為50 μg/mL的對照品溶液。

1.2.3 標準曲線的制備 分別吸取2、5、10、15、20 μL對照品溶液注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線。

1.2.4 樣品的制備及檢測[6]分別取玉屏風超微粉和玉屏風散各2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇100 mL，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀，計算玉屏風超微粉和玉屏風散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

1.2.5 專屬性試驗 依據處方中的比例，制備缺黃芪的陰性樣品，按樣品的制備方法制備陰性溶液，注入高效液相色譜儀，與對照品溶液、樣品溶液圖譜進行對比，考察方法的專屬性。

1.2.6 精密度和重復性的考察 分別精密吸取對照品10 μL，連續進樣6次，記錄峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，考察系統精密度。同一批次樣品重復進樣6次，記錄峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，考察方法重復性。

1.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出率測定

1.3.1 人工胃液的配制[7]取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋至1000 mL，即得，檢測pH值為1.8。

1.3.2 漿法測藥物溶出度 調整溶出儀參數，使溶出儀槳葉底部距溶出杯的內底部25 mm，加入人工胃液500 mL，開啟溫度控制。待人工胃液溫度恒定到37℃時，分別取玉屏風超微粉和玉屏風散各15 g加入溶出儀中，以50 r/min轉速啟動溶出儀，并開始計時。于加入藥物后0.083、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24、30 h，分別取樣品溶液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜過濾，注入高效液相色譜儀檢測。每次取樣后補充1 mL同溫度人工胃液至溶出儀中。計算各時間點毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出的總量，以總含量為參比，計算各時間點的累積溶出百分率，繪制溶出曲線。

2 結果與分析

2.1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量檢測方法的建立 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、不含黃芪陰性樣品、玉屏風超微粉的液相色譜圖分別見圖1～圖3。從色譜圖看出，毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時間在約10 min位置，陰性樣品無雜質峰干擾，分離度良好，說明該方法特異性較好。標準曲線方程為y=1023.3x+11.317，線性系數r為0.9996，說明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.1～1 μg含量范圍內線性關系良好。精密度試驗的RSD為0.86%，說明該方法精密度良好。重復性試驗的RSD為1.57%，說明方法的重復性較好，滿足含量測定要求。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品Fig 1 The reference substance of Hairy Isoflavone Glucoside

圖2 不含黃芪的陰性樣品Fig 2 Negative samples without Astragalus

圖3 玉屏風超微粉樣品Fig 3 The sample of Yupingfeng Utra-micropowder

2.2 玉屏風超微粉和玉屏風散含量檢測結果 經高效液相色譜儀檢測，同批次的玉屏風超微粉和玉屏風散的含量分別是0.256和0.248 mg/g，超微粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量比散劑含量提高3%，說明，藥物經超微粉碎后，有效成分溶出更多。

2.3 玉屏風超微粉和玉屏風散溶出率比較 分別檢測各時間點人工胃液中藥物濃度，計算累積溶出率，結果見圖4。圖4可看出，將藥物加入溶出儀中后，超微粉和散劑的毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積溶出率在5 min時差別不明顯散劑。超微粉的最快溶出時間段在0～2 h，溶出速度明顯高于散劑，2 h后累積溶出率緩慢增加，最后在16 h達到平衡，累積溶出率為80.36%。散劑的最快溶出時間段在0～6 h，6 h后累積溶出率緩慢增加，最后也在16 h達到平衡，累積溶出率為77.51%。

圖4 兩種劑型的累積溶出率曲線圖Fig 4 The cumulative dissolution rate curve graph of two dosage forms

3 討論與結論

3.1 檢測方法的建立 試驗建立了玉屏風散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的高效液相色譜檢測方法，其色譜條件為流動相：乙腈-0.2%甲酸(35∶65)，避開了中華人民共和國獸藥典(二部)[6]中的梯度洗脫方法，簡單方便，操作性強。而且該方法特異性較好，無黃芪陰性樣品無雜質峰干擾，樣品峰分離度良好，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.1～1 μg含量范圍內線性關系良好。方法的精密度、重復性較好，滿足含量測定要求，可用于玉屏風散或玉屏風超微粉的質量控制或相關含量研究。

3.2 玉屏風超微粉和玉屏風散含量檢測 玉屏風超微粉與散劑相比，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量提高了3%，可能是細胞壁在粉碎過程中被破壞，有效成分無需穿透細胞壁即可釋放，釋放速度和釋放量得到提高，能維持藥材原有的藥效。

3.3 玉屏風超微粉和玉屏風散溶出率檢測 目前已有不少關于超微粉藥物溶出率的研究報道，但大多都是選用水為溶出介質進行試驗[8-9]。本實驗選用人工胃液作為介質，更加接近機體真實狀態，更能反應藥物真實溶出情況。試驗結果發現玉屏風超微粉和玉屏風散中毛蕊異黃酮葡萄糖苷溶出率在5 min均能達到73%，說明超微粉和散劑在人工胃液中溶出均較好，利于提高生物利用度，但超微粉的溶出率在5 min時并不明顯高于散劑，可能是因為藥材經超微粉碎后，顆粒在一定程度上比表面積增大，導致分散性和流動性變差，從而在溶劑中更容易聚集，造成藥粉與溶媒接觸的比表面積下降，不利于成分的溶出。

經超微粉碎后，粉體粒徑變小、分布均勻、比表面積顯著增大、孔隙率增加、溶解性提高、親和力上升，有利于其藥效成分溶出[10]。試驗也發現玉屏風超微粉在2 h時毛蕊異黃酮葡萄糖苷累積溶出率接近平衡，散劑則在6 h累積溶出率接近平衡，且超微粉累積溶出率也高于散劑，說明藥物進入機體后超微粉比散劑溶出速率高，達峰時間縮短。

散劑散劑中藥材粉碎成超微粉后，大多數有效成分如多糖類、皂苷類和黃酮類會溶出速率增加[10]，也有少部分有效成分如生物堿等會溶出減慢，這與溶出介質，活性成分理化性質，溶解度等緊密相關[12]。因此超微粉應用時，應根據具體用藥情況，制定合理生產和應用方案，才能更好發揮中獸藥超微粉的優勢。