牛蒡苷元在仔豬體內的藥物動力學研究

何斌，吳利軍，陳夏冰，楊文海，邵志勇， 陳潔，金爾光，周華,李杰，劉志偉

(1.武漢市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2.武漢市動物疫病預防控制中心，武漢 430000)

牛蒡子的主要有效成分為木脂素類化合物，包括牛蒡苷和牛蒡苷元等，牛蒡苷在胃腸道微生物作用下轉化為牛蒡苷元發(fā)揮藥理作用，即牛蒡苷元為牛蒡子的直接有效成分[1-2]。牛蒡苷元具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]、抗糖尿病[7]等眾多藥理作用，具有良好的研發(fā)和應用前景；試驗研究了靜脈注射牛蒡甘元在仔豬體內的藥物代謝動力學特征，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論依據(jù)和參考，為中獸藥現(xiàn)代化進行有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及配制 牛蒡苷元標準品(批號：160509)含量≥98.1%，由上海融禾醫(yī)藥科技有限公司生產；準確稱取牛蒡苷元標準品，甲醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元1.0 mg/mL的標準貯備液；準確稱取牛蒡苷元標準品，丙二醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元10.0 mg/mL的注射液。乙腈、甲醇色譜級，購自美國 Themo公司；二氯甲烷、丙二醇等分析純，購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器 1200型高效液相色譜儀，自動進樣器、紫外檢測器，美國AgiLent公司；D3024R 高速離心機，SCILO-GEX公司；電子天平(±0.0001 g)，德國賽多利斯公司；N-EVAPTM111型氮吹儀，美國路易公司。

1.1.3 動物 杜×長×大三元仔豬8頭，雌雄各半，編號1-8號，體重：30.0±5.0 kg；購于武漢博牧生物科技有限公司。試驗前正常飼養(yǎng)觀察1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的全價日糧。

1.2 方法

1.2.1 藥物動力學試驗設計 給藥前12.0 h 禁食，對每頭仔豬進行稱重，并采集血樣作為空白對照。1～8號仔豬以2.0 mg/kg.bw的牛蒡甘元耳靜脈注射給藥。靜脈注射給藥后，每頭仔豬于0.167、0.333、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h采血5.0 mL左右；所采集血樣置于已加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r/min離心15.0 min分離血漿，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測定[12]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為AgiLent SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為280 nm；流動相為甲醇：乙腈：水(31∶20∶49 V∶V∶V)；流速為0.8 mL/min；進樣量為30 μL；柱溫為(30±0.1)℃[8-9]。

1.2.3 血漿樣品處理 將血漿樣品從-20 ℃冰箱中取出，室溫下自然解凍，準確吸取0.5 mL于5.0 mL離心管中，加入2.0 mL二氯甲烷，渦旋振蕩60 s后以10 000 r/min離心10.0 min吸取二氯甲烷層，同法提取兩次，合并兩次二氯甲烷層，置于15.0 mL離心管中，40 ℃水浴氮氣吹干，殘渣用200 μL流動相溶解，10 000 r/min離心10.0 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾后以30 μL進樣分析，記錄色譜圖[10-11]。

1.2.4 血漿標準曲線的建立 向7支5.0 mL聚丙烯離心管中各加入500 μL空白血漿，然后依次加入一系列已稀釋好的牛蒡苷元標準工作液，得到藥物濃度依次為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的血漿樣品。分別按照血漿樣品處理方法處理，進行HPLC分析，記錄色譜圖。以測得的牛蒡苷元峰面積(x)為橫坐標，濃度(y)為縱坐標，建立血漿標準曲線，擬合回歸方程，求出相關系數(shù)(r)。

1.2.5 方法學驗證 取空白血漿500 μL置于5.0 mL聚丙烯離心管中，然后依次加入已稀釋好的牛蒡苷元標準工作液高、中、低三個濃度，充分混合均勻，配制成含牛蒡苷元濃度分別為5.0、1.0、0.1 μg/mL的血漿樣品，按照血漿處理方法進行處理，進行HPLC檢測分析，每個濃度一天內設置5個平行進行檢測，以考察日內變異系數(shù)；連續(xù)重復檢測5 d，以測定日間變異系數(shù)。并計算方法的回收率、準確度、精密度以及靈敏度。

1.2.6 豬血漿中藥物濃度的測定 將給藥后不同時間點獲得的血漿，按“血漿樣品的處理”方法處理后進行HPLC分析，計算牛蒡苷元的峰面積，代入標準曲線回歸方程，計算出血漿中牛蒡苷元的濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用ExceL軟件分析處理方法學數(shù)據(jù)并繪制血漿標準工作曲線及藥-時曲線圖；藥物動力學模型擬合及參數(shù)計算均采用中國藥理學會數(shù)學專業(yè)委員會編制的3p97藥物動力學軟件分析。

2 結果與分析

2.1 牛蒡苷元在血漿中的色譜行為 在本研究所建立的方法下，牛蒡苷元保留時間為14.0 min，峰形對稱性良好，基線平穩(wěn)，與雜質峰分離良好，檢測效率高。空白血漿色譜圖如圖1，空白血漿添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖如圖2，樣品(0.55 μg/mL)血漿色譜圖如圖3。

圖1 空白血漿色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma

圖2 空白血漿中添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖Fig 2 Chromatogram of plasma with arctigenin (1.0 μ g/mL)

圖3 給藥后血漿中牛蒡苷元(0.55μg/mL)色譜圖Fig 3 Chromatogram of arctigenin in plasma (0.55 μg/mL) after administration

2.2 血漿標準工作曲線 由圖4可知，牛蒡苷元標準品在0.05～10.0 μg/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)r=0.9998，線性方程為y=0.0265x-0.0328(x表示牛蒡苷元的峰面積；y表示牛蒡苷元在血漿中的濃度)。

圖4 牛蒡苷元在血漿中標準工作曲線Fig 4 Calibration curve of arctigenin in piglet plasma

2.3 方法學驗證結果 由表1和表2可知，牛蒡苷元在仔豬血漿中的最低檢測限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。牛蒡苷元在0.05～5.0 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0.0264x-0.0295，相關系數(shù)為r=0.9998。該方法回收率大于83.35%，日內變異系數(shù)均在3.51%以內，日間變異系數(shù)均在5.90%以內

表1 仔豬空白血漿中添加ACT的回收率和 日內變異系數(shù)考察結果(n=5)Tab 1 Intra-day recovery and precision vaLues for the determination of ACT in pig plasma(n=5)

表2 仔豬空白血漿中添加ACT的回收率和 日間變異系數(shù)考察結果(n=5)Tab 2 Inter-day recovery and precision values for the determination of ACT in pig plasma(n=5)

2.4 藥物動力學試驗結果 單劑量靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw)后，在仔豬體內的血藥濃度如表3，主要藥物動力學參數(shù)如表4，血藥濃度-時間曲線如圖5。

表3 靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw)后在仔豬體內的血藥濃度Tab 3 Blood concentration of arctigenin in piglets after intravenous injection (2.0 mg/kg.bw)

ND表示未檢出

表4 靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw) 后在仔豬體內的藥物動力學參數(shù)Tab 4 Pharmacokinetic parameters of arctigenin (2.0 mg/kg.bw) in piglets after intravenous injection

圖5 靜脈注射牛蒡苷元(2mg/kg)后在 仔豬體內的血藥濃度-時間曲線Fig 5 Blood concentration-time curve of arctigenin in piglets after intravenous injection (2.0 mg/kg)

靜脈注射牛蒡苷元后，牛蒡苷元仔豬體內的分布半衰期(t1/2α)為0.166±0.022 h、消除半衰期t1/2β為3.161±0.296 h，表觀分布容積(Vd)為0.231±0.033 L/kg，藥時曲線下面積(AUC)1.189±0.057μg·h·mL-1。

3 討論與結論

牛蒡苷元的色譜條件目前報道不多。在檢測波長方面，選擇280 nm作為紫外檢測波長。關于流動相的選擇文獻報道的主要有以下幾種：乙腈：水(V∶V，32∶68)[8]；甲醇 ∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸(V∶V∶V，40∶20∶40)[13]；甲醇 ∶0.5%磷酸水(V∶V，48∶52)[14]；甲醇 ∶乙腈 ∶水(V∶V∶V，40∶20∶40)[10]；甲醇 ∶水(V∶V，55∶45)[9]。在試驗過程中，對以上流動相均進行了試驗研究，發(fā)現(xiàn)V(甲醇)∶V(水)=55∶45作為流動相，牛蒡苷元的出峰時間較理想、峰型較好且與雜質峰分離良好，但有時存在基線不穩(wěn)的情況；分析可能是甲醇和水在40%～60%的范圍內由儀器自動混合時極易產生氣泡，導致基線不穩(wěn)，故對流動相稍作更改，在流動相中加入乙腈，并不斷調整各流動相的比例，最終確定流動相為甲醇 ∶乙腈 ∶水=31∶20∶49(V∶V∶V)時出峰時間理想，峰形較好，且與雜質峰良好分離。

給仔豬靜脈注射牛蒡苷元后，牛蒡苷元仔豬體內的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)符合無吸收二室模型，與呂佳報道[10]的家兔靜注牛蒡苷元無吸收單室模型有一定的差異；在仔豬體內的分布半衰期t1/2α(0.166±0.022 h)較短，表觀分布容積Vd(0.307±0.033 L/kg)相對較小，表明靜注后牛蒡苷元在仔豬體內分布極為迅速，但分布組織相對較少，可能主要分布在主要分布在血液和細胞外液中[12]；消除半衰期t1/2β(3.161±0.296 h)相對較短，較家兔靜注牛蒡苷元0.87 h的消除半衰期長，可能與動物種屬有一定關系，表明牛蒡苷元靜脈注射后在仔豬體內消除代謝也相對較快，與其分布組織較少有一定關系。

研究采用HLPC建立了仔豬血漿中牛蒡苷元的定量分析方法，該方法具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短等特點，可應用于牛蒡苷元新獸藥的臨床前藥物動力學研究。研究了牛蒡苷元在仔豬體內的藥物動力學特征。結果表明：靜脈注射牛蒡苷元后，其在仔豬體內的為無吸收二室模型，在仔豬組織中分布較少，半衰期短、能迅速從仔豬血液中清除，發(fā)揮藥物作用時間較短，建議臨床使用時應適當增加用藥次數(shù)。