Th17/Treg及其相關炎性介質在重癥膿毒癥中的表達機制研究

文明祥 孫鴻鵬 潘渝 梅華鮮 葉八寧 施賢清

（貴州省人民醫院 貴州 貴陽 550002）

重癥膿毒癥是由感染所引起的全身炎癥反應所引發的疾病，由于其發病過程中容易導致患者體內多種炎癥細胞和炎癥介質的產生，繼而誘導炎癥的級聯反應，導致患者易出現各器官功能紊亂和衰竭，嚴重的情況下會產生休克和死亡等惡性臨床事件。在最新的研究指出，重癥膿毒癥是炎癥反應中促炎和抗炎反應相互影響的結果[1]。然而在炎癥反應中，Th17細胞及其相關炎癥介質（IL-6、IL-17）的促炎作用和Treg細胞及其相關炎癥介質（IL-10、TGF-β）的抗炎作用被認為最具有代表性。因此，本文以Th17和Treg細胞及其炎癥介質作為重癥膿毒癥的發病機制進行研究，為重癥膿毒癥的臨床研究提供依據和參考。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月-10月在我院接受治療的重癥膿毒癥患者35例作為研究組，同時選取健康人群（35例）作為對照組，兩組患者在病程、年齡、男女性別比例、病歷等資料上均無顯著差異。其中準入標準為ACCP（美國胸科醫師學院）和SCCM（美國危重疾病醫學會）共識會議制定的診斷標準。其中排除標準：患有哮喘、紅斑狼瘡、類風濕關節炎等免疫系統疾病的患者；患者出現休克等意識不全的患者；患有艾滋病、急性冠脈綜合癥、腫瘤、肝炎的患者；患者在住院2個月內使用激素類藥物和免疫抑制類藥物的。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測樣本收集 對研究組和對照組的研究對象全部實施靜脈抽血（5ml）來獲得其外周血的樣本，其中重癥膿毒癥患者必須在確診1h內實施靜脈抽血,并將獲得的血液樣本滴加肝素做抗凝處理后，置于冰箱（-4℃）下保存備用。

1.2.2 流式細胞技術檢測Th17與Treg細胞 在每個檢測的樣本中分別取出50ul、100ul分別用于檢測樣本中Th17與Treg細胞的含量。在50 ul血液樣本中添加IL-17APE(EB 公司、5ul)，同時在100 ul血液樣本中添加CD-ECD-CD25-PC5-CD127-PE(EB 公司、10ul)，常溫下避光培養15分鐘，添加紅細胞裂解液，并繼續避光培養10分鐘后，添加PBS（1.5ml）后離心5分鐘（1500轉/分）去上清（重復一次）。將獲得的產物置于流式細胞儀上檢測Th17和Treg細胞的含量，其中IL-17A+、CD4+、CD3+、CD3射門均為Th17細胞，而CD4+CD25+CD127為Treg細胞。

1.2.3 Th17細胞相關IL-6、IL-17和Treg細胞相關IL-10、TGF-β的檢測 對Th17細胞相關IL-6、IL-17和Treg細胞相關IL-10、TGF-β的檢測應用ELISA法，具體的實驗操作，參照ELISA試劑盒（上海極威生物科技有限公司）的操作指南進行。

1.3 統計學分析

數據采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17和Treg細胞的含量顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統計學意義，見表1。

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果（）

表1 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17、Treg細胞的檢測結果（）

組別 樣本數 Th17（%） Treg（%）研究組 35 5.73±0.31 9.53±0.51對照組 35 2.35±0.26 5.98±0.26

2.2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th17/Treg值顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統計學意義，見表2。

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結果（）

表2 重癥膿毒癥患者外周血液中Th17/Treg的比值分析結果（）

組別 樣本數 Th17/Treg研究組 35 0.601±0.062對照組 35 0.393 ±0.029

2.3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果分析

重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達量顯著升高（較對照組），P＜0.05，差異顯著有統計學意義，見表3。

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果（）

表3 重癥膿毒癥患者外周血液中IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的檢測結果（）

TGF-β（Pg/ml）研究組 35 33.62±8.69 113.52±12.61 39.15±9.26 45.36±9.75對照組 35 11.39±3.95 35.41±7.51 12.33±4.26 18.32±5.11組別 樣本數 IL-6（Pg/ml）IL-17（Pg/ml）IL-10（Pg/ml）

3.討論

在重癥膿毒癥的臨床和發病機理研究中，炎癥反應是導致其發生的核心病理變化過程，其中最具有代表性的促炎細胞為Th17細胞，及其相關的促炎因子IL-6、IL-17，而最具有代表性的抗炎細胞為Treg細胞，及其相關的抗炎因子IL-10、TGF-β。國內外專家指出，Th17細胞和Treg細胞的動態平衡過程是決定重癥膿毒癥病變的核心環節，當Th17細胞增多且功能增強時，往往會誘導體內激烈的炎癥反應，從而促進重癥膿毒癥的發生；而當Treg細胞增多且功能增強時，能導致Th17細胞失活和凋亡，從而抑制炎癥反應的進程，進而標志著重癥膿毒癥得到一定的控制。然而國內外報道中并沒有從患者外周血液的Th17、Treg和其相關炎癥因子的表達變化情況中尋找到直接證據，來充分說明Th17、Treg參與重癥膿毒癥的生物學機制。

因此，本文對Th17和Treg細胞及其炎癥介質作為重癥膿毒癥的發病機制進行研究。研究結果表明，重癥膿毒癥患者的外周血液樣本中Th1和Treg細胞的含量，IL-6、IL-17、IL-10、TGF-β的表達量、Th17/Treg值都顯著升高（較對照組）。而這一結果也表明了，體內的炎癥反應是重癥膿毒發病的重要因素之一；Th17/Treg值的升高表明患者體內促炎反應（Th17）明顯強于其抗炎反應（Treg）。