鞘蕊蘇赤霉素氧化酶基因的克隆及表達研究△

黃曉，張恬，馬朝芝，劉焱文，余坤*，黃必勝*

1.湖北中醫藥大學 藥學院，湖北 武漢 430065；2.中國中醫科學院 中藥資源中心，北京 100700

鞘蕊蘇藥材的基原植物為毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Wild.)Briq.，主產于印度，在中國云南、福建亦有分布，被植物學家界定為珍稀植物[1]。鞘蕊蘇以全草入藥，民間主要用于治療哮喘[2]、咳嗽等疾患，療效很好[3]。鑒于鞘蕊蘇良好藥效作用，本實驗室與企業實施產學研結合，以鞘蕊蘇為君藥，開發了鞘蕊蘇膠囊。現代科學研究表明，鞘蕊蘇有效成分為二萜類化合物異佛司可林(isoforskolin)[4]。

萜類化合物以5碳異戊二烯(IPP)及其異構體二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)為原料[5]，通過異戊二烯轉移酶催化連接而成。IPP和DMAPP以“頭-尾”方式相連形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)[6]，通過法尼基焦磷酸合成酶(FPS)的作用，GPP與1分子IPP結合形成法尼基焦磷酸(FPP)[7]，再通過牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)作用，FPP與1分子IPP形成牻牛兒基焦磷酸(GGPP)[8]，GGPP是二萜化合物的前體物質。本研究通過反轉錄PCR技術克隆得到赤霉素氧化酶基因，并成功地構建了基因的表達載體。通過對GA氧化酶基因的克隆及表達載體構建，研究二萜類化合物的合成途徑中相關酶的功能，為提高湖北通城種植鞘蕊蘇藥材中異佛司可林含量奠定基礎。

1 材料

鞘蕊蘇植物移植自湖北省通城縣鞘蕊蘇藥材集中種植基地，經湖北中醫藥大學藥學院生藥教研室吳和珍教授鑒定為唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Willd.)Briq.，將其植株種植于實驗室，保證植株健康的生理狀態，以備后續實驗需要。

pMD18-T Vector(大連寶生物科技有限公司)，DH5α感受態細胞(天根生化科技有限公司)，PGEX-4T-1表達載體(中國醫學科學院藥用植物研究所陳士林課題組贈予)，QIAGEN RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN技術有限公司)，質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，3′-FμLl RACE試劑盒、LaTaq酶、DNA Marker(TaKaRa公司)，2×EasqTaqMix(北京全式金生物技術公司)，Hind Ⅲ和XbaⅠ限制性內切酶、PrimeScripTM 1stStrand cDNA synthesis Kit.SYBR PrimeScripTM RT-PCR Kit、Primer start Gxl高保真酶、DNA Marker(TaKaRa 公司)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 鞘蕊蘇赤霉素CfGA01全長的克隆

步驟1：選取高通量轉錄組測序分析結果中的赤霉素氧化酶基因片段，設計5′引物(CfGAS-outer TCTGGCGGCACTGAAATCCA，CfGAS-inner CCAGA-ATCTCGCACGCCATCTT)、3′引物(CfGAS-outer CTTGTGGTAGTTAGAATGGGC，CfGAS-inner TTGAAGA-AGCCCACCTCCT)進行巢氏RACE實驗，得到基因全長序列。

步驟2：利用DNAMAN軟件根據全長基因序列設計引物，并引入酶切位點(CfGAS-F-EcoR I gaattcACAACCACCACCAACACTCATCTCTCT，CfGAS-R-SalⅠgtcgacACCGGATGGAAGGGAGGGAACATTA)，用高保真DNA聚合酶擴增全長，反應體系(Prime star Gxl Polymerase 1 μL、5×Prime star Gxl Buffer 10 μL、F 1 μL、R 1 μL、cDNA 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、RNase free dH2O 28 μL)，PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃冷卻，待反應結束后將產物取出置于4 ℃保存。分別用EcoR I、SalⅠ對提取的重組質粒與表載體PFEX-4T-1進行雙酶切反應，反應體系(質粒/PFEX-4T-1 10 μL、10×K Buffer 5 μL、酶1 1 μL、酶2 1 μL、RNase free dH2O 33 μL)，反應條件：37 ℃反應3～8 h，65 ℃水浴15 min滅活限制性內切酶。

步驟3：用T4連接酶將載體和質粒雙酶切后的產物進行連接，得到帶有目的基因的重組質粒，具體反應體系及條件如下：連接酶T4 1 μL、10×T4Buffer 1 μL、載體膠回收產物4 μL、質粒膠回收產物4 μL，反應條件：16 ℃空氣浴連接3 h以上，取10 μL連接后的產物轉化到100 mL DH5α大腸桿菌感受態細胞中，pcr篩選陽性克隆，并將陽性克隆送于生工測序，將測序結果作比對后選取準確無誤的陽性單克隆2～4個，于37 ℃恒溫搖菌培養過夜，用以提取質粒，將提取的質粒取少量做雙酶切驗證，剩余的-20 ℃保存，表達載體構建結束，挑取陽性單克隆至2 mL的無菌EP管中，LB液體培養基培養2 h作為母菌，并加入40%甘油混勻，于-80 ℃保存[9]。

2.2 實時熒光相對定量PCR

利用百泰克多糖多酚植物總RNA抽提試劑盒提取鞘蕊蘇根、莖、葉和花各個組織的總RNA，然后分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(NanoDrop 2000)通過波長(A)檢測總RNA的質量和濃度。利用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將上述RNA反轉錄得到cDNA，利用TaKaRa公司的SYBR premix ExTaqkit試劑盒在Roche公司Light Cycler 480實時熒光定量儀上進行qPCR。

2.3 CfGA01基因功能驗證

將重組表達載體與空載體PGEX-4T-1轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，含空載體的大腸桿菌將被用作對照菌，利用IPTG誘導啟動子在大腸桿菌BL21(DE3)細胞中表達萜類合成酶基因，并確定蛋白表達的最佳IPTG濃度、最佳時間和最佳溫度。

3 結果與分析

3.1 RNA提取

通過瓊脂糖凝膠電泳(1.0%)檢測鞘蕊蘇根部和葉中提取的總RNA，觀察是否能清楚地看到28 s和18 s的條帶，由圖1觀察條帶清晰可見。將跑膠后的總RNA溶液用Nanodrop2000檢測濃度和純度，其A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值分別為2.01和2.13，表明有輕微降解，但它不影響后續實驗的正常過程。

圖1 鞘蕊蘇根和葉中提取的RNA的電泳圖

3.2 3′、5′-RACE擴增

根據高通量測序片段設計GSP1和GSP2引物。通用3′引物和5′引物進行巢式擴增，通過研究不同的退火溫度，擴增3′端和5′端得到與目標片段大小一致的條帶。通過凝膠回收目的片段，并將目的片段的膠回收產物與PMD18-T載體連接，連接產物轉DH5α感受態細胞中，菌落過夜生長，通過PCR挑選陽性克隆，選擇2～4個陽性克隆進行序列測序。通過凝膠電泳發現CfGA013′端最佳退火溫度為62 ℃，5′端最佳退火溫度為50 ℃(見圖2)。

圖2 3′RACE、5′RACE凝膠電泳圖(由上到下)

3.3 鞘蕊蘇CfGA01基因全長的拼接

測序結果用MEGA 6.0進行拼接，DNAMAN 6.0軟件進行分析，比對結果顯示CfGA01基因的總長度為1234 bp，包括5′非編碼區72 bp，993 bp開放閱讀框區，169 bp 3′非編碼，終止密碼子為TAA。氨基酸數量為408，分子量為45 874，其中開放閱讀框中的氨基酸數為355，分子量為39 606。見圖3。

3.4 CfGA01系統進化樹

山茶花Camellialipoensis、丹參SalviamiltiorrhizaBunge、牽牛花Ipomoeanil、大麻Marahmacrocarpa、毛狀煙草Nicotianatomentosiformis、野生煙草N.attenuata、美花煙草N.sylvestris、煙草N.tabacum、矮牽牛Petuniaxhybrida、節節麥Aegilopstauschiisubsp.tauschii、小麥Triticumaestivum植物的GAS蛋白進行多重比對，發現它們具有較高的同源性(見圖4)。通過構建系統進化樹，發現CfGA01蛋白與丹參GA蛋白的親緣關系比較近。

3.5 qPCR分析

CFGA01參與赤霉素合成，赤霉素是植物中的二萜類植物激素，能夠促進植物生長，對整個發育過程起著重要作用。圖5 qPCR結果表明CfGA01在根、莖、花和葉各個組織中都有分布，而分布于葉和花中相對較高。

3.6 原核蛋白表達分析

通過圖6 SDS-PAGE檢測結果顯示，IPTG濃度為1 mol·L-1后，溫度為20 ℃時，在上清液中有表達，但表達較少，大量蛋白成為包涵體。

4 討論

赤霉素在植物生長和發育中起著重要作用，如種子萌發、葉芽生長、葉柄伸長、葉片擴大、花形成和發育、果實成熟等都與赤霉素有著重要聯系。一般來說赤霉素的合成主要發生在植物的頂端部位，即分生能力較強的部位，如頂芽、發育葉和根尖。近年來隨著植物功能基因組學和蛋白質組學的發展，赤霉素研究取得重大進展，特別是赤霉素生物合成途徑，起關鍵作用的酶基因已在許多植物中克隆出來，如在擬南芥、水稻、豌豆、玉米、西紅柿、草莓、萵苣、煙草、大麥和南瓜等植物中都發現了參與赤霉素合成與代謝的基因[10]，然而在鞘蕊蘇中相關基因報道較少。

本研究基于前期外源性GA處理植株有效成分含量減少的現象，首次克隆并表達了鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶CfGA01，基因表達蛋白與煙草、小麥、丹參等的相似性都在80%以上，進化關系與丹參最相近，表明該基因序列比較保守。在qPCR的實驗中，研究發現鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶在葉中表達量最多，而在根中表達量較少，這種表達趨勢不同于模式植物擬南芥和水稻的研究[11]，表明鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶的合成及富集有其獨特性。在鞘蕊蘇不同組織中有效成分異佛司可林含量的研究中，發現葉中異佛司可林含量最低，而根中含量最高，這同赤霉素氧化酶的表達量正好相反。赤霉素與異佛司可林由共同的前提化合物經過生物反應得到，研究赤霉素氧化酶的功能，為研究異佛司可林的生物合成提供科學依據，為后續提高栽培鞘蕊蘇有效成分含量奠定基礎。

圖3 鞘蕊蘇CfGA01基因全長序列圖

圖4 鞘蕊蘇CfGA01同源系統進化樹

圖5 CfGA01在鞘蕊蘇不同器官的相對表達量

圖6 PGEX-4T-1-CfGA01蛋白表達圖