遼寧老鸛草屬植物花粉形態特征比較△

劉維雅，尹海波，谷靜逸，李旭，張堇訸，鄧聰，王娜，任雪

1.遼寧省衛生健康委員會，遼寧 沈陽 110000；2.遼寧中醫藥大學，遼寧 大連 116600

孢粉與其他生殖器官一樣，較少受環境的影響，其形態較為穩定，且Erdtman[1]認為，利用花粉粒形態特征可以提高一些植物分類精確度，對于種內分類具有重要意義。近年來，不少學者借助SEM觀察植物的花粉形態，對同屬植物不同種或品種進行分類鑒定，為探究種間親緣關系提供參考[2-3]。老鸛草為我國常用中藥，全草入藥，具有祛風除濕的功效；目前關于老鸛草屬植物花粉形態的報道中，光景森、Yanazaki等[4]分別對牻牛兒苗、老鸛草屬20種植物進行花粉粒形態的描述；譚仲明等[5]曾對四川省老鸛草屬植物的花粉形態進行觀察研究，具有一定的系統學意義，但并未生成較為系統的分類依據；劉娟等[6]曾對黑龍江省4種老鸛草屬植物的花粉形態進行研究，但并未做分類研究；尹海波[7]曾對東北地區9種老鸛草屬植物的花粉進行光鏡觀察，并編寫分類檢索表。我國有老鸛草屬植物55種[8]，其中分布于遼寧省的有7種[9]，目前尚無文獻對遼寧老鸛草屬植物的分類進行系統梳理，闡明老鸛草屬植物是否存在分類爭議，故本文利用掃描電子顯微鏡對遼寧省老鸛草屬植物花粉形態特征進行觀察，通過花粉形態的差異對7種老鸛草進行聚類分析，并編寫分類檢索表，為老鸛草屬植物種類鑒定和分類提供更多依據，以期為該屬植物的孢粉學研究提供新資料。

1 材料與方法

1.1 材料

花粉材料均于2015年8—9月采自遼寧省東部山區，并經大連自然博物館張淑梅教授和遼寧中醫藥大學藥用植物教研室尹海波教授鑒定。樣品來源信息見表1。

1.2 方法

取成熟飽滿的花蕾，置于硫酸紙袋中，硅膠干燥，用鑷子分別將干燥花粉均勻鋪置于1 cm×1 cm的導電雙面膠帶上，另一面黏在掃描電鏡樣品臺上，用離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層15 nm厚的金膜。將處理好的樣品放入樣品盒中，用場發射掃描電子顯微鏡(SU8010日立)進行掃描、拍照。

1.3 統計分析

每種隨機選取成熟飽滿的花粉粒20粒，花粉粒大小用極軸長(E)×赤道軸長(P)表示，極軸和赤道軸比(P/E)表示花粉粒形狀，P/E在0.88～1.14為近球形[10]。在掃描電鏡下對表面紋飾棒狀體、網眼、溝寬和溝深進行觀察并測量，采用SPSS軟件分別計算均值和標準差，然后對7種老鸛草之間的大致親緣關系進行聚類、編寫檢索表。

2 結果與分析

2.1 花粉大小和形態特征

在掃描電鏡下，7種老鸛草屬植物的花粉粒均為近球形；不同種老鸛草屬植物的花粉粒大小差異有統計學意義(P<0.05)，其中毛蕊老鸛草的花粉粒最大，其次分別為突節老鸛草和朝鮮老鸛草、長白老鸛草、塊根老鸛草、老鸛草，鼠掌老鸛草的花粉粒最小，該結果與原植物花直徑的大小一致，即花粉粒大的花朵也大。另外，花粉粒具3孔溝，溝短，3條孔溝作120°等分分布，部分孔溝有清晰的內含物，可作為遼寧省老鸛草屬植物花粉的主要鑒別特征。詳見表2和圖1。

表1 老鸛草屬植物樣品基本信息

表2 7種老鸛草屬植物花粉形態特征的比較(n=3)

注：同一列不同字母表示差異有統計學意義，P<0.05。

注：a.赤道面觀；b.極面觀；c.外壁一紋飾；d.外壁二紋飾；1.老鸛草；2.鼠掌老鸛草；3.塊根老鸛草；4.突節老鸛草；5.朝鮮老鸛草；6.長白老鸛草；7.毛蕊老鸛草。圖1 掃描電鏡下老鸛草屬7個種的花粉形態

2.2 花粉外壁紋飾

孢子花粉的外壁紋飾是細分孢子屬種的重要特征之一[10]。本實驗的7種老鸛草屬植物花粉均為復合紋飾，外壁一為短棒狀紋飾，外壁二為網狀紋飾。但棒狀形態及大小、網紋均勻程度和大小有較明顯差異，見表2。其中，網眼大小、萌發溝寬和溝深經方差分析后差異有統計學意義，而棒狀體的差異主要體現在其形態和大小均勻程度上。

2.3 聚類分析

用歐式距離法對赤道軸長、極軸長、棒狀體大小、網眼大小、赤道面觀中的溝寬和溝深6個指標進行聚類分析，見圖2。若以鏈接距離17來劃分，7種老鸛草大致可分為兩類，突節老鸛草、朝鮮老鸛草、毛蕊老鸛草為一類，老鸛草、鼠掌老鸛草、塊根老鸛草和長白老鸛草為一類。其中，老鸛草和鼠掌老鸛草親緣關系最為接近，突節老鸛草和毛蕊老鸛草的親緣關系較為接近，該歸類結果與ISSR分子標記的親緣關系聚類結果稍有出入[11]，但可將大花組和小花組完全分開。

2.4 花粉特征檢索表

花粉作為植物的保守結構，其形態特征具有可遺傳性，同時具有科屬的共同特征和種的特異性，可將花粉形態特征作為植物的分類依據[10]。

3 結論與討論

3.1 對遼寧省老鸛草屬植物的考證

據《中國植物志》記載，北方老鸛草G.erianthumDC.產于吉林省東部；《東北草本植物志》收錄老鸛草屬植物共9種，其中記載遼寧省內有6種，另記載北方老鸛草在吉林省多個縣內均有分布；《遼寧植物志》共收載老鸛草屬植物7種，亦未將毛蕊老鸛草G.eriostemonFish.ex DC.列入其中，而將G.erianthumDC.收錄。本實驗取材主要基于以下兩點：一是《中國植物志》第43卷成書于1997年，《東北草本植物志》第6卷成書于1977年，《遼寧植物志》成書于1988年。不難推測，《東北草本植物志》對遼寧省僅有6種的記載實為紕漏，成書最晚的《中國植物志》明確收載于《遼寧植物志》的G.erianthumDC.一種產于吉林省，該說法與《東北草本植物志》的信息一致，而G.erianthumDC.和G.eriostemonFish.ex DC.在親緣關系上極為相近[11]，因此，初步判斷《遼寧植物志》對G.erianthumDC.

1.花粉粒較大，大于(90×90)μm2

2.外壁一紋飾的棒狀大小無明顯差異

G.krameriFranch.et Sav.Enum.

2.外壁一紋飾的棒狀大小差異明顯

3.棒狀末端表面具一條帶狀凸起

G.paishanenseY.L.Chang.

3.棒狀末端表面具多條帶狀凸起 …………………………………………………G.eriostemonFish.ex DC.

1.花粉粒較小，<(90×90)μm2

4.外壁一紋飾的棒狀大小差異明顯

G.koreanumKom.in Act.

4.外壁一紋飾的棒狀大小無明顯差異

5.棒狀體末端表面具瘤狀凸起

G.sibiricumL.

5.棒狀體末端表面具帶狀凸起

6.外壁二網狀紋飾的網眼直徑>2 μm

G.eranimdahuricumDC.

6.外壁二網狀紋飾的網眼直徑<2 μm …………………………………………G.wilfordiiMaxim.

圖2 7種老鸛草屬植物花粉特征聚類分析

很可能為誤定。二是在實地考察中，2014、2015年6—9月在遼寧省調查了近200個天然山區，其中包括《遼寧植物志》中對G.erianthumDC.有收錄的桓仁、寬甸等山區，并未發現G.erianthumDC.，而G.eriostemonFish.ex DC.在遼寧山區尤其本溪縣內普遍分布較多；后又考察了中國科學院沈陽生態所(中國科學院林業土壤研究所前身)的憑證標本，該標本現無根部、無花果部位，唯有3大3小葉片存留，雖葉裂均至3/4處，但就目前不完整的信息并不能排除是G.eriostemonFish.ex DC.的可能性。此外，曾在該所G.erianthumDC.標本的標注地區桓仁老禿頂多次進行較大規模的考察，依然未能發現該種。綜合以上兩點考證，筆者可初步斷定遼寧省的老鸛草屬植物共7種，分別為G.wilfordiiMaxim.、G.sibiricumL.、G.eranimdahuricumDC.、G.krameriFranch.et Sav.Enum.、G.koreanumKom.in Act.、G.paishanenseY.L.Chang.和G.eriostemonFish.ex DC.，而更正了《遼寧植物志》中的G.erianthumDC.，結論為老鸛草屬植物的開發利用和擴大藥源提供了參考。

3.2 花粉形態特征在屬下階元劃分的意義

據前期研究發現，7種老鸛草外觀形態差異極小，僅從葉片的分裂個數及花的大小來進行區別。而在掃描電鏡下，7個老鸛草屬植物的花粉均為近球形，三萌發孔，溝短而粗，表面均為棒狀-網紋復合紋飾，表明老鸛草屬植物這一自然類群具有較穩定的共同特征。該7種老鸛草屬植物的花粉表面雖同為棒狀-網狀復合紋飾，但在花粉大小、棒狀形態及大小、網紋飾均等程度和大小、萌發孔溝寬、溝深等方面均有不同程度的差異。而這些差異表明以上特征在植物分類和開發藥用資源上具有重要的分類學價值，但是否可以作為該屬植物分類、鑒定的重要依據還需對其他老鸛草屬植物的花粉作進一步相關研究后方可得知，目前僅能對遼寧省內的老鸛草屬植物進行初步分類。

3.3 關于聚類分析與傳統分類結果不完全相符問題

首先，在依據外部形態對屬下系劃分的傳統分類下，突節老鸛草和塊根老鸛草的親緣關系最為接近的觀點已由ISSR分子標記技術研究證實[12]，而圖2的聚類結果表明，突節老鸛草和毛蕊老鸛草的親緣關系最為接近，進而表明花粉粒特征的系統聚類并不能夠反映遼寧省內老鸛草屬不同種之間的親緣關系。但聚類結果卻準確地將原植物形態上的大花組和小花組劃分開來，而塊根老鸛草和突節老鸛草雖然外觀形態極為相似，親緣關系也最為接近，但兩者最顯著的差異在于花的大小，突節老鸛草花直徑在2～3 cm，塊根老鸛草花直徑1.5 cm左右。因此，根據花粉形態特征將塊根老鸛草與花直徑<2 cm的老鸛草和鼠掌老鸛草歸為一類，實由原植物花本身特征所決定，雖與全株的親緣關系略有差異，卻也在情理之中；其次，本文的數據源于每種20粒花粉的大小，20個紋飾指標觀測值，最終比較均值，觀察數量的有限難免也會對聚類結果產生一定影響；再者，從SEM鏡下不難看出，一些花粉粒或多或少有變形現象產生，加之測量的人為誤差，個別數據的不準確亦可能影響聚類結果。但靠孢粉學證據對遼寧省的老鸛草種進行分類已可初步實現，而對親緣關系的考察無法單靠孢粉學證據完成，卻在老鸛草屬植物種的分類上具有一定的實際意義，該結果可為老鸛草屬植物的資源開發奠定一定的基礎。