UPLC同時測定香加皮中六種成分△

姚鵬，李洋，杜昆澤，李晉，常艷旭*

1.福建省衛生健康委員會 中醫藥管理處，福建 福州 350002；2.天津中醫藥大學/天津市現代中藥重點實驗室，天津 300193

香加皮為蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumBge.的干燥根皮，其性溫，味辛、苦，有毒，歸肝、腎、心經，具有祛風濕、強筋骨的功效，用于治療風寒濕痹、腰膝酸軟、心悸氣短、下肢浮腫[1]。此外，香加皮還具有強心、抗炎、抗腫瘤、促神經纖維增長、誘導細胞分化的作用[2-4]。據文獻記載，香加皮中含100多種化學成分，包括C21甾體類化合物、強心苷類化合物、萜類化合物、脂肪酸類及揮發油類等化合物[5-8]。其中，杠柳毒苷、杠柳苷元和杠柳次苷是香加皮中的3個主要強心成分。有文獻報道，杠柳毒苷能夠調節心血管疾病，具有強心作用[9]，但與此同時，該化合物的含量也與動物死亡率有較強相關性[10]，且其在體內迅速代謝成為杠柳苷元和杠柳次苷[11]，因此對杠柳毒苷、杠柳苷元和杠柳次苷3種化合物的含量測定尤其重要，可為香加皮中毒性成分限量標準考察提供依據。東莨菪內酯是香加皮中的活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎等良好的藥理作用[12-13]。異香草醛和4-甲氧基水楊醛是香加皮中主要的香氣成分，4-甲氧基水楊醛更是《中華人民共和國藥典》中唯一的質量控制指標性成分。近年來，對香加皮中化學成分含量測定的方法主要是傳統高效液相色譜法，而且測定指標比較單一，主要集中在杠柳毒苷及4-甲氧基水楊醛這個兩個化合物[14-15]。目前，UPLC被廣泛地應用到中藥質量控制的研究中[16-17]。該方法分離效果好、效率高，能快速對目標化合物進行分離分析。本研究采用UPLC同時測定香加皮藥材中6種化學成分(杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷、4-甲氧基水楊醛、東莨菪內酯和異香草醛)的含量，并測定不同產地、不同批次的香加皮藥材，比較不同批次香加皮樣品中6種成分含量差異，擬為香加皮毒性和質量標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀；十萬分之一電子天平(AX205瑞士Mettler Toledo公司)；BP121S萬分之一天平(德國Sartorius公司)；SB-1000YDTD超聲清洗槽(寧波新芝生物科技股份有限公司)；3K15高速離心機(美國Sigma公司)；XW-80A旋渦混合器(上海滬西分析儀器廠)；FW135粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑

杠柳毒苷(批號：15072212，純度99.18%)、杠柳苷元(批號：15072211，純度99.81%)、杠柳次苷(批號：15080311，純度99.93%)、東莨菪內酯(批號：14081804，純度≥98%)，均購自成都曼斯特生物科技有限公司。4-甲氧基水楊醛(批號：20170225，純度98%)、異香草醛(批號：20170225，純度98%)，均購自天津萬象恒遠科技有限公司。乙腈(色譜純，Merck公司)；甲醇(色譜純，Merck公司)；甲酸(色譜純，美國ACS恩科化學)；超純水(Millipore公司)。

1.3 藥材

香加皮藥材購自不同產地。經天津中醫藥大學常艷旭研究員鑒定為蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumBge.的干燥根皮，樣品保存于天津中醫藥大學中醫藥研究院。香加皮樣品粉碎過60目篩，備用。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，)，保護柱：Waters C18柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，流動相A：乙腈(含0.05%甲酸)，流動相B：超純水(含0.05%甲酸)，流速：0.3 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進樣體積：2 μL，檢測波長分別為：220、280、340 nm，分析時間：39 min。梯度洗脫程序如下：0～2 min，8%～10%B；2～3 min，10%～10%B；3～4 min，10%～10.5%B；4～5 min，10.5%～12%B；5～9 min，12%～13%B；9～11 min，13%～15%B；11～12 min，15%～19%B；12～14 min，19%～24%B；14～15 min，24%～25%B；15～17 min，25%～25%B；17～20 min，25%～26%B；20～23 min，26%～40%B；23～25 min，40%～47%B；25～27 min，47%～47%B；27～30 min，47%～56%B；30～32 min，56%～78%B；32～34 min，78%～98%B；34～35 min，98%～100%B；35～38 min，100%～100%B；38～39 min，100%～8%B。

1.4.2 樣品溶液制備 精密稱取不同產地、不同批次香加皮粉末0.5 g，用100%甲醇超聲提取30 min，靜置冷卻后用純甲醇補足體積，14 000 r·min-1離心10 min，兩次，取上清液作為樣品溶液。

1.4.3 對照品溶液制備 分別準確稱取一定量異香草醛、4-甲氧基水楊醛、東莨菪內酯、杠柳毒苷、杠柳苷元、杠柳次苷對照品粉末，用純甲醇溶解配制使其質量濃度均為1.00 mg·mL-1，再依次稀釋至適當的濃度，備用。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

UPLC是基于傳統高效液相色譜法的理論及原理發展起來的，是分離科學中一項全新的類別，它涵蓋細小顆粒的填料、較低系統體積以及有效快速檢測等新技術，同時，在靈敏度、色譜峰容量、分析通量方面都有所提高。目前多采用反相色譜法，以非極性的C18鍵合的硅膠為固定相、色譜柱的粒徑可達3.5 μm，甚至1.7 μm，有利于分析物的分離[18]。與傳統高效液相色譜法相比，UPLC的分析速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍、1.7倍，它縮短了分析時間，同時減少了有機試劑用量，降低了分析的成本。UPLC多采用水、甲醇、乙腈做為流動相進行洗脫。

本實驗根據待測物中化合物不同性質，為達到最佳分離效果，對流動相的組成、柱溫、流速等進行了考察和優化。采用乙腈-水梯度洗脫，考察了在超純水中加入(0.05%、0.1%、0.2%甲酸)和乙腈中加入(0.05%、0.1%、0.2%甲酸)、柱溫(30、35、40 ℃)以及流速(0.2、0.3、0.4 mL·min-1)。結果表明，流動相為0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水、柱溫30 ℃和流速0.3 mL·min-1時對香加皮樣品進行梯度洗脫，各化合物基線分離較好、靈敏度高、峰形較好，且成本較低。

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線及線性范圍 本實驗采用外標法同時測定香加皮中6個化合物的含量，并對不同產地香加皮藥材質量進行檢測。將異香草醛(100 μg·mL-1)、東莨菪內酯(100 μg·mL-1)、4-甲氧基水楊醛(400 μg·mL-1)、杠柳毒苷(700 μg·mL-1)、杠柳次苷(200 μg·mL-1)和杠柳苷元(400 μg·mL-1)6個對照品溶液配成混合對照品儲備液母液。精密移取一定量各濃度對照品儲備液，按不同稀釋倍數用純甲醇稀釋成一系列濃度的混合對照品溶液，依次進樣測定，以濃度(μg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線。以信噪比S/N為3∶1作為其檢測限(LOD)，S/N為10∶1作為其定量限(LOQ)。各化合物的標準曲線及線性范圍見表1，從表1中可知，6個化合物在各自線性范圍內r均大于0.999 0，表明6個化合物在其線性范圍內線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗 取香加皮中各成分的對照品適量，按一定體積混合配制成混對照品母液，經過一系列逐級稀釋，將其稀釋成高、中、低3個濃度，在色譜條件下連續進樣6次，且連續進樣3 d，計算6個化合物峰面積的RSD值，并且根據標準曲線計算6個化合物的濃度值，將測得的濃度值與實際濃度值進行比較，得到各化合物的準確度，考察儀器的日內精密度和日間精密度。結果顯示，各化學成分的峰面積RSD均小于5%，表明儀器的精密度良好。見表2。

2.2.3 重復性試驗 取同一批次香加皮樣品(四川1)，按照樣品溶液制備方法平行提取6份，在優化的色譜分析條件下連續進樣，計算6種化合物峰面積的RSD值。結果各化合物峰面積RSD值均小于5%，表明其重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 按照樣品溶液制備方法制備樣品溶液(四川1)，按照優化的色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h內進樣同一樣品溶液，分別計算6種化合物峰面積的RSD值。結果顯示峰面積的RSD值均小于5%，可見樣品在24 h內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次(四川1)已知含量的香加皮藥材粉末(0.25 g)，平行取樣6份，分別加入各對照品溶液適量，按照樣品溶液的制備方法處理并測定，按公式(1)計算各個化學成分的平均回收率，結果見表3。

(1)

表1 香加皮中6種化學成分的線性范圍、LOD及LOQ

表2 香加皮中6種化學成分的日內精密度、日間精密度(n=3)

表3 香加皮中6種化學成分的加樣回收率試驗結果(n=3)

2.3 香加皮中6種化學成分含量測定

精密稱定20批不同產地、不同批次香加皮藥材粉末，按照制備供試品溶液的方法制備，并根據上述的色譜條件進樣分析，圖1為樣品溶液與混合對照品溶液的高效液相色譜圖(波長分別為280、220、340 nm)。根據上述標準曲線及線性范圍所得的回歸方程計算不同批次供試品溶液中6種化學成分的含量，結果見表4。

注：A.香加皮樣品280 nm；B.混合對照品280 nm；C.香加皮樣品340 nm；D.混合對照品340 nm；E.香加皮樣品220 nm；F.混合對照品220 nm；1.異香草醛；2.東莨菪內酯；3.4-甲氧基水楊醛；4.杠柳毒苷；5.杠柳苷元；6.杠柳次苷。圖1 香加皮樣品與混合對照品的高效液相色譜圖

批次化學成分質量分數杠柳毒苷杠柳苷元杠柳次苷異香草醛東莨菪內酯4-甲氧基水楊醛河南A1.19——0.360.093.64河南B2.24—0.060.440.044.02東北12.70—0.220.220.122.44東北20.82——0.210.062.33東北33.730.180.300.150.082.65河北14.980.03—0.340.022.46河北23.81—0.070.290.082.82四川11.960.120.270.380.072.61甘肅16.260.170.300.120.082.58湖北12.66—0.130.330.123.01湖北005.72—0.150.290.112.83湖北772.21—0.190.220.162.02山西A1.09—0.080.360.073.11山西B1.72—0.080.410.134.00山西C0.230.05—0.270.073.67山西3.68——0.300.102.77山西25.68—0.070.700.073.70山西554.80—0.050.230.062.32內蒙古11.46——0.340.072.93河南12.580.030.170.210.091.39

注：—表示該化合物含量低于定量限。

從上述不同產地、不同批次香加皮樣品中6種成分含量測定結果可知，不同產地、不同批次香加皮藥材含量存在差異，其中杠柳毒苷成分含量差異最大，且《中華人民共和國藥典》沒有對其毒性成分限量標準規定，給大眾用藥帶來一定的安全隱患。《中華人民共和國藥典》規定，本品按照干燥品計算，含4-甲氧基水楊醛(C8H8O3)不得少于0.20%，除河南1產地外，剩余19批香加皮藥材均符合《中華人民共和國藥典》規定(4-甲氧基水楊醛含量均在2.02～4.02 mg·g-1)。因此，采用本實驗超高效液相色譜法可以對香加皮中多種化學成分進行質量控制研究，需要結合毒性實驗對其毒性成分進行限量考察，建立符合安全用藥原則中藥香加皮毒性成分限量方法。

3 結論

建立了超高效液相-紫外檢測法同時測定香加皮中6種活性化合物，包括3種毒性成分杠柳毒苷、杠柳次苷和杠柳苷元。該方法具有檢測靈敏度高、重復性好、穩定可靠，各化合物的回收率在可接受范圍內，可應用于不同產地香加皮中6種化合物的含量測定，為香加皮的質量控制研究提供參考。