制首烏多糖Fe(Ⅲ)配合物的合成及吸附動力學(xué)研究△

李石清，袁強(qiáng)，蔣福升，張婷，張春椿

浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根。黑豆汁制后具有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨等功效。其中，制首烏多糖為其主要有效成分，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血機(jī)能等作用[1-2]。因多糖分子中含有游離氨基(-NH2)和羥基(-OH)，在氮原子上，孤對電子可投入至金屬離子空軌道中，與Zn2+、Cu2+、Fe3+金屬離子反應(yīng)，形成配合物[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過將精制的首烏多糖與FeCl3配合反應(yīng)，研究其吸附動力學(xué)特性，為制首烏資源的利用及新型口服補(bǔ)鐵劑的開發(fā)提供研究思路。

鐵是構(gòu)成人體必不可少的微量元素之一，可以促進(jìn)發(fā)育，調(diào)節(jié)呼吸功能，增加機(jī)體的免疫力，治療和預(yù)防因缺鐵而引起的貧血。缺鐵對人體發(fā)育、行為和智力、抵抗力等方面均有較大影響[5]。目前，臨床上一般以亞鐵Fe(Ⅱ)制劑作為常用補(bǔ)鐵劑，但偶有胃腸道刺激等不良反應(yīng)，在穩(wěn)定性和生物利用度方面也存在一些問題，其在體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基，可能會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，中藥提取物多糖Fe(Ⅲ)配合物作為補(bǔ)鐵劑，具有生物利用率高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，對胃腸道副作用小。制首烏多糖作為其抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血機(jī)能的主要有效成分，開發(fā)成補(bǔ)鐵劑后有望起到補(bǔ)鐵兼顧養(yǎng)血的功效[7]。

1 材料

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；BS224S精密電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；DF-101S集熱型恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)。

制首烏購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源研究所俞冰副教授鑒定為何首烏PolygonummultiflorumThunb.干燥塊根黑豆汁制后的炮制品。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 精制制首烏多糖的制備

取100 g制首烏藥材，干燥，80%乙醇索氏回流脫色，揮干溶媒，加30倍量水浸泡1 h后，煎煮2 h，過濾，冷卻，37 ℃水浴，加α-淀粉酶適量進(jìn)行水解，至制首烏水提液與碘液反應(yīng)呈陰性，100 ℃煮沸20 min除酶，濃縮至200 mL，氨水調(diào)pH至8，置50 ℃水浴鍋中，邊加H2O2邊攪拌，直至呈現(xiàn)淺黃色，保溫2 h，揮去多余氨，sevage法除蛋白，濃縮至25 mL，加3倍量95%乙醇，靜置過夜，抽濾取沉淀，蒸餾水溶解，流水透析2 d，蒸餾水浸泡透析1 d，濃縮至20 mL，加4倍量的95%乙醇，抽濾，取沉淀，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚潤洗，真空干燥[3，8]，得粉紅色精制多糖。

2.2 精制制首烏多糖Fe(Ⅲ)配合物的合成

稱取制首烏多糖1.0 g、檸檬酸三鈉0.5 g，分別加到250 mL三頸瓶中，用蒸餾水50 mL溶解。置于70 ℃水浴中，一邊緩緩滴加10%NaOH溶液和2 mol·L-1FeCl3溶液，一邊攪拌，控制溶液pH值為7～8。當(dāng)出現(xiàn)棕紅色不溶性沉淀時(shí)，立即停止滴加10%NaOH溶液和2 mol·L-1FeCl3溶液，繼續(xù)在熱水浴中攪拌1 h。待反應(yīng)液冷卻后，3500 r·min-1離心15 min。取上層深紅棕色的液體，加入4倍量體積95%乙醇，靜置，使紅棕色沉淀物質(zhì)沉淀完全。離心分離，沉淀物質(zhì)分別用95%乙醇、無水乙醇和無水乙醚各洗3次以上，進(jìn)行真空干燥，得到制首烏多糖Fe(Ⅲ)配合物(PIC)粗品。

將所得PIC粗品溶于純凈水，流水透析48 h以上，除去鹽和小分子物質(zhì)，濃縮，加入4倍量體積95%乙醇，醇沉，沉淀物分別用95%乙醇、無水乙醇、無水乙醚各洗2次，真空干燥，得無定形紅褐色粉末的精制多糖Fe(Ⅲ)配合物1.02 g。

2.3 PIC的理化性質(zhì)

2.3.1 PIC的一般物理性質(zhì) PIC是紅褐色粉末，無臭、無味，易溶于水中，水溶液呈中性，不溶于無水甲醇、無水乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。

2.3.2 PIC的穩(wěn)定性試驗(yàn) 透析除鹽后的PIC易溶于水，用K4[Fe(CN)6]檢驗(yàn)其水溶液[8]，未顯示Fe3+的特性，證實(shí)PIC水溶液中不存在游離Fe3+，說明所生成的配合物較穩(wěn)定。

2.3.3 PIC的水解實(shí)驗(yàn) 分別配制濃度為0.01 mol·L-1FeSO4、FeCl3、PIC(PIC中Fe3+濃度為0.01 mol·L-1)，準(zhǔn)確吸取上述溶液20 mL，分別用0.01 mol·L-1NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，同時(shí)測pH值變化。結(jié)果，pH值為2.56時(shí)，F(xiàn)eCl3開始沉淀，pH值為6.67時(shí)，出現(xiàn)大量的沉淀物。pH值為3.45時(shí)，F(xiàn)eSO4開始沉淀，pH值為6.69時(shí)，出現(xiàn)大量的沉淀物。PIC在pH值3～12內(nèi)均未出現(xiàn)沉淀，pH值<3時(shí)開始出現(xiàn)沉淀物，說明PIC在pH值3～12穩(wěn)定。

2.4 制首烏多糖Fe(Ⅲ)配合物的吸附動力學(xué)研究

2.4.1 Fe3+含量測定 分別準(zhǔn)確移取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL質(zhì)量濃度為 10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)Fe3+溶液，置于25 mL量瓶，再加入1 mL的10%鹽酸羥胺溶液，2.5 mL的1 g·L-1鄰菲羅啉顯色液和5 mL的1 mol·L-1NaAc溶液，用蒸餾水稀釋至刻度后搖勻，放置10～15 min，以相對應(yīng)試劑作為空白，于510 nm處測定吸光度。Fe3+濃度作為縱坐標(biāo)，吸光度作為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：Y=6.137 3X-0.031 1，r=0.999 3。

2.4.2 吸附速率實(shí)驗(yàn) 在50 mL燒杯中，放入精確稱取的制首烏多糖0.05 g，加純凈水19 mL，另取2 mol·L-1的Fe3+溶液1 mL混勻，置25 ℃恒溫振蕩容器中以100 r·min-1的恒速振蕩，使其充分吸附，分別在15、30、60、90、120、180、240 min，取10 μL溶液，分別置于25 mL的容量瓶中，同2.4.1操作方法測吸光度，繪制其吸附動力學(xué)的速率曲線。因反應(yīng)溶液中Fe3+溶液所加入量固定，制首烏多糖鐵配合物含量不同，而隨時(shí)間變化，表現(xiàn)出吸附變化曲線。結(jié)果見圖1。

圖1 制首烏多糖對Fe(Ⅲ)的吸附速率曲線

2.4.3 等溫吸附實(shí)驗(yàn) 精密稱取制首烏精制多糖0.05 g，平行5份，分別置50 mL帶塞的三角錐瓶中，加蒸餾水19 mL，然后加2 mol·L-1Fe3+溶液1 mL，搖勻，分別置10、25、35、45、60 ℃恒溫振蕩器中，以100 r·min-1的恒速進(jìn)行振蕩。反應(yīng)1 h，取10 μL溶液置25 mL容量瓶中，同2.4.1操作方法測吸光度，并繪制吸附等溫線，因反應(yīng)溶液中Fe3+溶液所加入量固定，制首烏多糖鐵配合物含量不同，而表現(xiàn)出吸附曲線。結(jié)果見圖2。

圖2 制首烏多糖對Fe(Ⅲ)的吸附等溫曲線

2.5 PIC還原性實(shí)驗(yàn)

精密稱定PIC 0.2 g，置100 mL的容量瓶中，加蒸餾水、定溶至刻度，備用。分別取pH值為1、2、3、4、5、6、7、8的HCl或NaOH溶液85 mL，分別取PIC儲備液10.0 mL于100 mL容量瓶中，并加入10%的抗壞血酸溶液3 mL，加入適量的稀NaOH或HCl溶液，定容，使溶液pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，混勻，置37 ℃的水浴中進(jìn)行還原反應(yīng)[9]。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)，分別取還原液置25 mL容量瓶中，同2.4.1操作分別測吸光度。結(jié)果見表1。

表1 吸光度與溶液pH值及反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系

2.6 PIC紅外光譜分析

紅外光譜分析可用于研究分子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，也可以作為表征和鑒別化學(xué)物種的方法，本實(shí)驗(yàn)對制首烏多糖與制首烏多糖鐵的紅外譜圖進(jìn)行比較研究，并與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)比進(jìn)行較。

紅外光譜圖(圖3)顯示，在3500～3400 cm-1附近有強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)，可能是由于制首烏多糖分子中有多個(gè)較強(qiáng)氫鍵作用的-OH存在，為制首烏多糖中羥基的伸縮振動吸收峰。通過制首烏多糖和制首烏多糖鐵紅外光譜對照，發(fā)現(xiàn)制首烏多糖的結(jié)構(gòu)并沒有因金屬離子絡(luò)合反應(yīng)而發(fā)生改變。1023、1021 cm-1是分別與葡聚糖存在狀態(tài)有關(guān)[10-11]。制首烏多糖鐵在700、900 cm-1左右處的特征吸收與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的β-FeOOH的特征吸收一致[12]，表明制首烏多糖配合物中的鐵核可能是以聚合的β-FeOOH結(jié)構(gòu)存在。

注：A.制首烏多糖；B.制首烏多糖鐵。圖3 制首烏多糖與制首烏多糖鐵紅外光譜分析譜圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉、脫色及透析等方法制備精制制首烏多糖，制備了制首烏多糖鐵配合物，并確定了制首烏多糖鐵配合物的理化性質(zhì)：紅褐色粉末，無味，不溶于無水甲醇、無水乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，易溶于水，并且其水溶液呈中性，其pH值3～12相對穩(wěn)定。PIC水溶液中不存在游離的Fe3+，說明生成了相對較為穩(wěn)定配合物。故口服后可避免游離鐵離子對胃腸道造成刺激。

吸附動力學(xué)研究表明，在同一溫度、不同時(shí)間下，制首烏多糖對Fe(Ⅲ)的吸附量隨時(shí)間增加不斷增大，并于1 h后基本達(dá)到穩(wěn)定；在同一時(shí)間、不同溫度下制首烏多糖對Fe(Ⅲ)的吸附量隨溫度的升高而逐漸增大。在相同pH值下、不同時(shí)間下，PIC的還原性隨時(shí)間不斷增大于2 h后基本達(dá)到最大；在同一時(shí)間、不同pH值下，PIC的還原性隨pH值的升高而逐漸增大。

鐵在人體發(fā)育中具有重要的作用，可以促進(jìn)發(fā)育，調(diào)節(jié)呼吸功能，增加機(jī)體的免疫力，治療和預(yù)防因缺鐵而引起的貧血。缺鐵對人體發(fā)育、行為和智力、抵抗力等方面均有較大影響。補(bǔ)鐵劑使用不當(dāng)，可在體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源性自由基，會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷。中藥提取物多糖Fe(Ⅲ)配合物作為補(bǔ)鐵劑，具有生物利用率高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，對胃腸道副作用小。經(jīng)黑豆汁制后的何首烏不僅具有補(bǔ)肝腎、益精血、強(qiáng)筋骨等功效，而且其主要有效成分多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)造血機(jī)能等作用，制何首烏經(jīng)水提醇沉法提取物質(zhì)主要為多糖類成分，相對安全性高，而且釋放出鐵后的配體多糖還具有多種生物活性，可能有兼顧造血與補(bǔ)鐵作用，故PIC可能有較高的生物利用度，有望成為一種新型的口服補(bǔ)鐵劑。