不同LED光質對陜產重樓生理特性和成分積累的影響△

李鉑，唐志書*，王楠，孫曉春，黃文靜，宋忠興，楊新杰，程虎印，黃柯朝

1.陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712083；2.秦藥特色資源研究與開發國家重點實驗室(培育)，陜西 咸陽 712083；3.陜西中醫藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046

光是植物生長發育最重要的生態因子和調節因子之一[1]，適宜的光質能夠影響藥用植物的初生代謝，調控不同次生代謝產物的積累和分配，從而影響藥材的產量和品質[2]。發光二極管(LED)作為新型光源，廣泛應用于設施農業、園藝作物、植物工廠等領域，在藥用植物人工栽培方面具有良好的應用前景，無論是作為唯一光源或補充光源，可以通過精準控制光照強度、混合光質組合，提高藥用植物的產量和質量。

七葉一枝花ParispolyphyllaSmith為百合科重樓屬多年生草本，又名重樓、蚤休、燈臺七、螺絲七[3]，主要分布于陜西南部、云南、四川、廣西、貴州等地，為特色秦藥之一[4]。重樓根和根莖入藥，富含皂苷類、多糖、三萜類、黃酮類等多種化合物，具有清熱解毒、消腫止痛等功效[5-6]。秦嶺地區氣候環境適宜，植被類型豐富，分布有七葉一枝花、寬葉重樓、柄葉重樓、北重樓等多種重樓屬植物[7-8]。重樓常生長于疏林下或灌叢陰濕處，喜涼爽、陰濕的環境，因此對光照強度和光質的選擇較為敏感。

重樓作為傳統中藥，隨著市場需求不斷增加，野生資源遭到極度破壞，重樓人工種植技術的突破和改進迫在眉睫，研究光質對重樓藥材產量和品質的影響具有重要的指導意義。本研究通過設置5種不同光質處理基質栽培的陜產重樓，通過測定不同生長期重樓生物量、葉綠素含量、蛋白質含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、總多糖和總皂苷含量，綜合多項指標，評價陜產重樓對不同LED光質的響應機制，為重樓藥材規范化種植過程中最適光質的選擇提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 儀器

Multiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；UV-2600紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)；萬分之一電子天平(日本Shimadzu公司)；101型電熱鼓風干燥箱(北京科偉永興儀器公司)。

1.2 試藥

葡萄糖(批號：180519)、重樓皂苷I(批號：180607)購自陜西樂博生化有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、總SOD活性檢測試劑盒(S0101)購自上海碧云天生物科技公司；其余試劑均為國產分析純。

三年生重樓幼苗采自陜西省商洛市鎮安縣云蓋寺鎮，經陜西中醫藥大學王繼濤教授鑒定為百合科重樓屬植物七葉一枝花P.polyphylla。取30 cm×25 cm塑料盆，裝入適量基質(PindStrup，Denmark，粒徑0～6 mm，pH 6.0)；挑選大小一致的重樓幼苗，洗凈，栽植于基質內，使芽尖露出基質表面，置于組織培養間培養(20 ℃，12 h光照/12 h黑暗，相對濕度55%～60%)，待葉片完全展開，用于不同光質處理。

1.3 方法

1.3.1 LED光源設置 分別設置LED紅光、藍光、紅光/藍光4∶1、紅光/藍光2∶1不同光質，不同顏色燈珠按比例均勻交叉排布，以白色熒光燈為對照(FL，T5，飛利浦照明工業有限公司)，調整光源數量和高度，使距離重樓葉片處的平均光照強度為80 μmol·(m2·s)-1。每個處理設3次重復，每重復30株苗，光周期：12 h光照/12 h黑暗(20 ℃、相對濕度55%～60%)，分別于處理10、20、30 d時取樣，新鮮樣品經液氮速凍，存于-80 ℃冰箱，用于葉綠素含量、蛋白含量和SOD酶活性測定；另取不同處理的重樓根莖洗凈，40 ℃烘干，粉碎過篩，用于多糖和總皂苷含量測定。LED光源由廣東偉照業光電節能有限公司制造，單支LED光源的相關參數見表1。

表1 LED光源相關參數

注：峰值波長代表不同LED光源的光強達到最大時對應的波長；—表示白光為全波長；組合光質的該值為兩種LED光源各自的峰值波長。

1.3.2 生物量測定 不同光質處理30 d后取樣一次，各處理隨機取樣3株，洗凈，拭干水分，分別測定并記錄地上部分與根莖的質量，根據公式(1)計算根冠比。

根冠比=地下部分(g)/地上部分(g)

(1)

1.3.3 葉綠素含量測定 精密稱取處理30 d的新鮮重樓葉片各0.1 g，洗凈，擦干，剪碎，加入適量80%丙酮，研磨至組織變白，過濾至25 mL容量瓶，定容，每個處理重復3次。分別在663、646 nm處測定提取液吸光值，按照文獻描述方法計算葉綠素a和葉綠素b含量[9]。

1.3.4 總蛋白含量與SOD酶活性測定 分別取不同光質處理10、20、30 d的新鮮重樓葉片，洗凈雜質，吸干水分，精確稱取0.5 g，加入5.0 mL磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)，冰上迅速研磨成勻漿，4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，上清液用于蛋白含量測定和SOD酶活性測定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定葉片中蛋白含量，蛋白含量以mg·g-1FW(鮮質量)表示；利用總SOD活性檢測試劑盒測定葉片中超氧化物歧化酶活性，SOD酶活力以U·mg-1蛋白含量表示。

1.3.5 總多糖含量測定

1.3.5.1 重樓粗多糖的制備 精密稱取重樓樣品0.250 g，置于錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，60 ℃超聲20 min，濾取上清液，向沉淀中加入10 mL蒸餾水，重復上述操作。合并兩次水提液，加入無水乙醇，使乙醇終濃度為80%。4 ℃靜置24 h，10 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，40 ℃烘箱內烘干至恒質量，得到重樓粗多糖粉末。向烘干的粗多糖粉末中加入25 mL蒸餾水，充分溶解，備用。

1.3.5.2 重樓多糖含量測定 重樓多糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定[10]。精密量取0.2 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液0、25、50、150、250、300 μL，蒸餾水補體積至300 μL，加入5%苯酚溶液1 mL，混勻；加入濃硫酸5 mL，搖勻并靜置10 min，40 ℃水浴15 min；取出后冰浴10 min，測定490 nm處吸光值。以葡萄糖對照品濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標，得到如下線性回歸方程：Y=9.941 8X+0.015 5，r=0.995 5(n=3)。分別吸取1.3.5.1項中待測樣品300 μL，按相同方法測定490 nm處吸光值，依據標準曲線計算多糖含量，多糖含量以mg·g-1DW(干質量)表示。

1.3.6 總皂苷含量測定 精密稱取重樓根莖粉末0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲提取15 min，用甲醇補足減少的質量。參考楊驍等[11]的方法進行測定，以重樓皂苷I作為對照品，重樓皂苷I含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到如下線性回歸方程：Y=3.026 8X-0.013 7，r=0.996 7(n=3)，表明重樓皂苷I在0～0.023 mg·mL-1線性關系良好。總皂苷含量以mg·g-1DW(干質量)表示。

1.4 數據分析

數據分析采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析結合多重比較進行多組樣本間的差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同LED光質對重樓生物量的影響

由表2可知，不同光質處理重樓植株30 d后，地上部分與根莖的生物量略有變化，2R1B處理的重樓地上部分生物量達到最大，地下部分生物量以4R1B處理為最高，但不同處理組與對照組相比均未達到顯著差異。同時，藍光和紅光/藍光2∶1處理的重樓根冠比減小，表明其對重樓地上部分生長的促進作用高于地下部分。

表2 不同LED光質對重樓生物量的影響

2.2 不同LED光質對重樓葉綠素含量的影響

重樓葉片中葉綠素含量在不同光質處理后變化明顯。葉綠素a含量在R、B與2R1B光質處理后均顯著增加，分別為對照組的1.331倍(P<0.05)、1.432倍(P<0.01)和1.521倍(P<0.01)。不同處理組葉片中葉綠素b含量均低于葉綠素a，B與2R1B處理組葉綠素b含量均顯著高于白光處理(CK)，分別為對照組的1.269倍(P<0.05)和1.445倍(P<0.01)，見圖1。結果表明，藍光和紅光/藍光2∶1處理均可顯著提高陜產重樓葉片中兩種葉綠素含量，以后者的處理效果為佳，其對重樓植株光合的影響有待進一步研究，以探明葉綠素含量增加與光合作用變化之間的關系。

注：Chl a.葉綠素a；Chl b.葉綠素b；分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖1 不同LED光質對重樓葉片中葉綠素含量的影響

2.3 不同LED光質對重樓葉片蛋白含量和SOD酶活性的影響

不同光質處理重樓植株，葉片中總蛋白含量相比對照組顯著增加。B、4R1B和2R1B處理10 d后葉片中蛋白含量均顯著增加，分別為對照組(白光)的1.741倍、1.312倍和1.313倍；不同光質處理重樓植株20 d，各處理組葉片蛋白質量分數在(69.579±2.100)～(92.171±2.286)mg·g-1FW；處理30 d后，不同光質處理的葉片中蛋白含量均顯著高于對照組，以紅/藍2∶1處理的蛋白含量為最高，是對照組的1.628倍(P<0.01)，藍光處理的重樓葉片蛋白含量為對照組的1.523倍，亦達到顯著差異(圖2)。因此，單色光以藍光處理的重樓葉片蛋白含量增加明顯，不同比例光質以紅光/藍光2∶1處理對重樓葉片蛋白積累的促進作用顯著。實際生產中可通過調整紅藍光質配比，提高重樓葉片中的蛋白質含量。

注：分別以白光處理作為對照，*代表P<0.05；**代表P<0.01。圖2 不同LED光質對重樓葉片蛋白含量的影響

由圖3可知，不同光質處理初期(10 d)，紅光和紅光/藍光4∶1處理的重樓葉片中SOD酶活性相比對照組(白光)有所上升。隨著處理時間的增加，各處理組葉片SOD酶活性相比對照均有所下降，以藍光和紅/藍2∶1處理組酶活性下降幅度明顯。處理30 d時，B、4R1B和2R1B處理的葉片中SOD活性均顯著降低，分別為(1.398±0.077)、(1.301±0.104)、(0.979±0.058)U·mg-1，均低于對照組葉片中SOD酶活性，以紅光/藍光2∶1處理的葉片SOD酶活性降幅為最大，相比對照組降低55.40%(P<0.01)。

注：分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖3 不同LED光質對重樓葉片SOD酶活性的影響

2.4 不同LED光質對重樓總多糖含量的影響

本研究中，不同光質不同時間處理的陜產重樓根莖中多糖含量相比對照組(白光)明顯升高。不同處理時間R、B和2R1B處理的重樓根莖中，多糖含量均在較高水平，以紅光/藍光2∶1處理的促進作用最為顯著，分別為對照組的1.918倍(10 d)、2.165倍(20 d)和3.151倍(30 d)。隨著紅光/藍光4∶1處理時間的延長，對重樓根莖中多糖含量的積累由抑制轉變為促進，處理30 d后根莖中多糖含量達(25.738±2.362)mg·g-1DW，顯著高于對照組(P<0.01，圖4)。綜合考慮，以紅光/藍光2∶1為提高陜產重樓根莖中多糖含量的最佳LED光質處理組合。

注：分別以白光處理作為對照，**P<0.01。圖4 不同LED光質對重樓根莖中多糖含量的影響

2.5 不同LED光質對重樓總皂苷含量的影響

由圖5可知，不同光質處理的重樓根莖中，重樓總皂苷含量隨處理時間的延長總體表現為逐漸升高的趨勢。紅光和藍光處理10 d，重樓根莖中總皂苷含量均顯著高于對照(白光)，以藍光處理的效果為好，達到(44.766±1.445)mg·g-1DW，相比對照組提高91.20%(P<0.01)。處理20 d時不同處理之間總皂苷含量無顯著差異。不同光質處理30 d時，總皂苷含量相比對照組均有所增加，以藍光處理的促進作用為最強，達到(63.343±4.269)mg·g-1DW，是對照組的1.595倍(P<0.01)。因此，藍光對陜產重樓根莖中總皂苷積累的促進作用最為顯著。

注：分別以白光處理作為對照，*P<0.05；**P<0.01。圖5 不同LED光質對重樓根莖中總皂苷含量的影響

3 討論

光是藥用植物積累同化產物的能量來源，次生代謝產物的合成與積累則依賴于植物體內的初生代謝。研究表明，不同光質的LED光源能夠影響植物的生長[12-13]、光合作用[14]、保護酶系統[15]，以及次生代謝產物的積累與轉化[16-17]。陜產重樓是秦巴山區特色秦藥之一，隨著市場需求的不斷增加，解決重樓人工栽培過程中的關鍵性問題迫在眉睫。本研究利用LED發光二極管，設置不同單色光質及混合光質組合，處理基質栽培的陜產重樓，分別考察植株生長、葉綠素含量、蛋白含量、超氧化物歧化酶活性、多糖含量和總皂苷積累對不同光質的響應。結果表明，紅光/藍光2∶1處理對重樓生長和生物量積累具有一定的促進作用，并能夠顯著提高葉片中葉綠素a、b的含量。葉綠素含量水平與植物的光合作用密切相關，黃希等[18]研究發現，橙光/藍光4∶1有利于促進滇重樓葉片的光合作用，本研究中紅光/藍光2∶1對陜產重樓光合作用的影響有待進一步探究。同時，本研究結果顯示，紅光/藍光2∶1處理對重樓葉片蛋白質含量具有顯著的促進作用，并能夠顯著降低葉片超氧化物歧化酶活性。

聞永慧等[19]利用不同光質LED處理白及二倍體與四倍體組培苗，發現紅/藍1∶1最有利于白及組培苗中多糖的積累；紅藍LED復合光照有利于鐵皮石斛葉綠素與多糖含量的增加，藍光則有利于種苗的增粗與生物堿的積累[16]。張勤濤等[20]利用藍光處理滇重樓，重樓產量及根莖中皂苷含量達到最高。重樓主要以根莖入藥，皂苷和多糖為根莖的主要成分。本研究結果顯示，紅光/藍光2∶1處理可顯著提高陜產重樓根莖中多糖的含量，而總皂苷含量的提高以LED藍光處理的效果為佳，這與上述文獻報道的結果基本一致。

LED光源是設施農業常用的技術手段之一，具有高效、節能、環保等優點，隨著珍稀藥用植物人工種植規模的擴大，充分利用LED光源在植株生長和有效成分積累關鍵期進行處理，可為提高藥材產量和品質提供參考。同時，進一步研究不同LED光質處理藥用植物后體內初生代謝與次生代謝之間的轉化，以及關鍵酶基因的表達、調控過程，闡明不同光質影響藥用植物生長和藥材品質形成的分子機制，可為合理利用LED光源指導藥材生產提供理論和實踐依據。