蛇足石杉不同天然居群的土壤酶活性研究△

王德立，齊耀東

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 海南分所，海南 海口 570311；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

蛇足石杉Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trevs，又名千層塔，隸屬石杉科石杉屬，為一種擬蕨類植物，多年生草本，高20～30 cm，生長于潮濕、富含腐殖質的林下。在我國主要分布在長江以南各省，尤以江西、安徽、湖南、重慶等地較多。該植物為我國一種傳統中藥材，以莖葉入藥，常用于治療瘀血腫痛、挫傷等[1]。現代研究表明，蛇足石杉植物體含石杉堿甲，對治療早老性癡呆效果較好，且毒副作用最小[2]。該物種也因此引起全世界人們的關注，對其原料需求量劇增。但該植物生長較為緩慢，年生長高度2～3 cm[3]，大量無序采集造成資源儲量迅速減少，野生資源分布范圍迅速萎縮，加上環境不斷變化，尤其是干旱氣候影響，導致部分地區的蛇足石杉儲量銳減甚至絕跡。

當前蛇足石杉資源儲量遠不能滿足市場需求，要解決原料短缺問題最為有效的措施是開展規模化種植，而目前迅速擴繁技術尚未成熟，致使規模化生產難以實施。蛇足石杉的主要繁殖方式為孢子繁殖和芽胞繁殖[4]。盡管由芽胞萌發生長至成熟孢子體的周期較短，但芽胞數量較少，不足以實施產業化。孢子繁殖是實施產業化的潛在方式，成株可每年產生幾個至幾十個孢子囊，每個孢子囊內含上萬個孢子。但在人工可控環境中如何促進大量孢子快速萌發是當前亟待解決的難題。在野外，成熟的孢子散落在富含腐殖質、潮濕的土壤中，于適宜條件下萌發，經過配子體世代形成孢子體。而在人工控制條件下孢子卻難以萌發，調查發現孢子休眠時間較長，幾年甚至十幾年，但休眠原因及打破休眠的方法尚不清楚。野生環境中可能存在促進孢子萌發的微生物和多種酶類。土壤中的酶類主要有：過氧化氫酶、多酚氧化酶、腺酶、蛋白酶、磷酸酶、脫氫酶和蔗糖酶等[5-6]，這些酶是土壤生化過程中重要參與者，在物質和能量交換過程中起重要作用[7]。

蛇足石杉適宜生長在多年生林地土壤中，土壤含有豐富的酶類，這些酶可能對蛇足石杉的孢子萌發和植株生長起到直接或間接的促進作用。蛇足石杉內生菌以及微生物促進孢子萌發已有研究[8-9]，目前尚未找到能夠促進孢子萌發的關鍵微生物，也未見關于土壤酶對蛇足石杉孢子萌發影響的報道。本研究擬通過分析以孢子繁殖為代表的重慶市黃水鎮蛇足石杉天然居群及以芽胞繁殖為代表的海南昌江霸王嶺自然保護區蛇足石杉天然居群的土壤酶活性差異，找出可能促進孢子萌發和植物生長的土壤酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣位置 土壤材料采集地點為重慶石柱縣黃水鎮，海拔1300 m左右，地理坐標：N27°29′，E108°39′；海南省霸王嶺自然保護區石峰，海拔1300 m左右，地理坐標：N18°50′，E109°05′。

1.1.2 樣地類型及采樣方法

1.1.2.1 重慶黃水鎮樣地(CQ) 該樣地蛇足石杉居群主要分布在生長10年以上的柳杉林下，居群大小視柳杉林地面積而定。分別采集生長5年、10年和15年的柳杉林內地表20 cm的土壤，其中10年和15年柳杉林地有蛇足石杉分布，10年林地內僅有幼苗和幼株，15年林地既有成株又有幼苗和幼株。每個居群采集6份土樣，每份土樣按X取樣法采集5份土樣混合而成。

1.1.2.2 海南霸王嶺樣地(HN) 該樣地包括東五樣地和東二樣地，其中東五樣地海拔1300 m左右，有蛇足石杉分布，居群面積約1200，該居群繁殖方式以芽胞繁殖為主，80%的幼苗來自芽胞，95%以上的成株均產生芽胞；東二樣地無蛇足石杉部分，海拔800 m左右。兩樣地均采用S取樣法在該居群中采集距地表20 cm左右的土壤。每個樣地、每種林地類型分別采集土樣6份。

1.2 測定方法

采用酶聯免疫法測定蛋白酶(活性單位為U·L-1)、過氧化氫酶(活性單位為IU·L-1)、多酚氧化酶(活性單位IU·L-1)、脲酶(活性單位IU·L-1)、蔗糖酶(活性單位U·L-1)、磷酸酶(活性單位為U·L-1)、纖維素酶(活性單位U·L-1)。

經測定標準溶液，得出7種酶活性的標準曲線方程：蛋白酶：Y=25.113 4X+0.178 3(r=0.998 4)；過氧化氫酶：Y=69.787X+3.454 9(r=0.998 3)；多酚氧化酶：Y=207.234 7X+8.858 2(r=0.998 3)；脲酶：Y=503.927 9X+8.234 5(r=0.998 3)；蔗糖酶：Y=425.528 8X+15.066 0(r=0.998 7)；磷酸酶：Y=413.770 9X+1.375 8(r=0.998 5)；纖維素酶：Y=82.528 5X+2.24(r=0.998 7)。

1.3 數據處理

數據用SPSS17.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 兩個蛇足石杉居群的土壤酶活性比較

土壤酶活性比較見表1。蛋白酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性：重慶15年林地>海南東五樣地；脲酶活性和蔗糖酶活性：重慶15年林地<海南東五樣地；纖維素酶活性、磷酸酶活性：兩樣地無顯著性差異。

表1 兩個蛇足石杉居群土壤酶活性比較

注：不同字母表示差異有統計學意義(P<0.05)；下同。

2.2 重慶不同株齡林地土壤酶活性比較

重慶黃水鎮不同株齡的柳杉林中土壤酶活性比較見表2。15年株齡的柳杉林地蛋白酶活性、過氧化氫酶活性及磷酸酶活性較高；5年和10年株齡柳杉林地多酚氧化酶、脲酶、蔗糖酶活性較高；5年株齡林地活性較低的土壤酶有蛋白酶、過氧化氫酶、磷酸酶。

2.3 海南霸王嶺兩樣地土壤酶活性比較

海南霸王嶺樣東五樣地和東二樣地土壤酶活性結果見表3。東二樣地蛋白酶活性、蔗糖酶活性、纖維素酶活性及磷酸酶活性均高于東五樣地，而過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶等酶活性無顯著差異。

3 討論

土壤酶包括胞內酶和胞外酶，主要來源于土壤微生物、植物根系分泌物和動植物殘體，是生態系統的物質循環和能量流動等生態過程中最為活躍的生物活性物質[7，10-11]。土壤酶種類和活性反映了土壤肥力狀況，影響根系對養分、水分的吸收，從而影響植物生長發育[12]。目前尚未實現蛇足石杉規模化種植，僅有小面積栽培，且種苗全部來自于野生，因此原生境對孢子萌發極其重要，原生境中的土壤酶可能對孢子萌發有促進作用，也會影響蛇足石杉生長發育。

表2 重慶黃水鎮不同株齡柳杉林地土壤酶活性

注：不同字母表示差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 海南霸王嶺東五樣地和東二樣地土壤酶活性

重慶黃水鎮15年柳杉林樣地和海南霸王嶺樣地均有蛇足石杉成株和大量幼苗，前者以孢子幼苗為主，后者以芽胞幼苗[4](芽胞為蛇足石杉無性繁殖體，從母株脫落后直接萌發成幼苗)為主。這表明重慶15年林地環境更適宜孢子繁育與植株生長。從兩個樣地的土壤酶活性來看(表1)，蛋白酶活性、過氧化氫酶活性和多酚氧化酶活性：重慶15年林地樣地>海南東五樣地，這表明這3種酶可能更有利于孢子萌發和植株生長。其中蛋白酶可促進孢子壁的溶解和相關蛋白質的轉化，以打破孢子休眠，促進孢子萌發；過氧化氫酶可有效保護孢子內原生質體中的多種物質，避免被氧化而失去活性；多酚氧化酶活性可有效避免在孢子萌發過程中受到病菌或其他有害物質的侵害，因此較高的多酚氧化酶活性更有利于孢子萌發。而海南東五樣地由于土壤蛋白酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性偏低，可能缺少孢子萌發的必要條件，因此孢子幼苗極少，而芽胞幼苗較多。脲酶、蔗糖酶、磷酸酶均分解土壤中的營養物質，其活力大小均反應了土壤肥力水平，這些酶活力高低直接影響植物長勢。這3種酶活性：海南東五顯著高于重慶15年林地樣地，這也進一步驗證了海南蛇足石杉生長速率高于重慶樣地的現象[3]。兩樣地的纖維素酶活性差異不顯著，這可能與兩樣地均為多年生次生林，地表均積累了豐富的枯枝、落葉有關。

由表2知重慶樣地不同生長年限的柳杉林土壤酶活性差異明顯。蛋白酶活性：15年>10年>5年，這說明隨著喬木生長年限增加，蛋白酶活性不斷增強，而5年林地沒有蛇足石杉分布，10年林地偶爾有分布，15年林地有大量分布，由此推測蛋白酶可能影響蛇足石杉孢子萌發。過氧化氫酶活性：15年=10年>5年，即10年之后林地土壤過氧化氫酶活性變化不大，該酶也可能對孢子萌發起促進作用。多酚氧化酶在不同年限林地間無規律的變化趨勢，而脲酶、蔗糖酶的纖維素酶的活性5年株齡林地最高，15年株齡林地較低，這說明林地早期階段為待分解的營養較多，也是物質快速轉化階段。磷酸酶活性隨著林地年限的增加呈增強趨勢，這表明土壤中可被直接吸收的磷元素減少，磷酸酶活性增加可將土壤中難溶性磷轉化為可溶性磷，為植物提供可直接吸收的磷元素。

海南蛇足石杉居群的主要繁殖方式為芽胞繁殖，該繁殖方式與孢子繁殖不同，不需要經過孢子萌發形成配子體即沒有配子體世代。該樣地有蛇足石杉分布的居群土壤蛋白酶、蔗糖酶、纖維素酶和磷酸酶均低于無蛇足石杉分布的居群，過氧化氫酶、多酚氧化酶及脲酶差異無統計學意義(表3)。這種差異可能源自環境溫度不同，有蛇足石杉的樣地海拔1300 m左右，而無蛇足石杉的樣地海拔800 m左右。由此可以看出溫度對蛇足石杉的芽胞萌發和植株生長影響較大，雖然養分條件較好，但較高的溫度也不適宜蛇足石杉生長，這與蛇足石杉喜溫涼、耐嚴寒、怕高溫的生物學特性有關。

由此推測，蛇足石杉孢子萌發及植株生長可能與多種土壤酶活性息息相關。蛋白酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶可能對孢子萌發有重要影響，脲酶、蔗糖酶、纖維素酶和磷酸酶可能和植株生長有關。因此在孢子培養過程中可適當加入相應的酶以促進孢子萌發和幼苗生長。