利用分子標記技術聚合2 個白葉枯病基因改良華占的白葉枯病抗性

倪深 夏春 應建成 孫紅偉 陳紅旗

（中國水稻研究所/水稻生物學國家重點實驗室，杭州310006；*通訊作者：chqhzfy@126.com）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是我國65%以上人口的主食[1]。水稻在生長過程中會遭受各種病蟲害的入侵，其中白葉枯病是影響水稻產量的主要病害之一。白葉枯病菌侵害常造成水稻減產20%～40%，嚴重時甚至顆粒無收[2]。目前大面積推廣的水稻品種多數不抗白葉枯病，用藥防治效果差、成本高，且嚴重污染環境。培育攜帶白葉枯病抗性基因的水稻新品種，是控制水稻白葉枯病發生和蔓延最為經濟和有效的一種途徑。

20 世紀80—90年代，我國栽培稻的白葉枯病抗源主要為Xa4 和Xa3，但在栽培稻種植的過程中，有些原先無毒小種發生了變異，還有些具毒性的劣勢小種上升為優勢小種，導致水稻品種逐漸喪失抗性。xa5 和Xa7 等廣譜抗性基因逐漸應用于改良常規稻品種和雜交稻親本的白葉枯病抗性[3]，這2 個抗性基因源自孟加拉國的3 個品種DV85、DV86 和DZ78。xa5 定位于5 號染色體短臂末端SNPS 標記RS7 和SSR 標記RM611之間，遺傳距離為0.5 cM，物理距離接近70 kb[3]，Xa7是孕穗期專抗的顯性基因，定位于6 號染色體上標記GDSSR02 和RM20593 之間，遺傳距離分別為0.07 cM和0.14 cM[4]。

華占是中國水稻研究所通過系統選育的秈型恢復系，具有恢復力強、配合力好、綜合性狀好等特點，以其為親本已經選育了100 多個組合。但該恢復系感白葉枯病，為此，本研究利用回交結合分子標記輔助選擇技術導入xa5 和Xa7 抗性基因，以提高華占對白葉枯病的抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性基因供體親本分別為IRBB5（xa5）、鎮R084（Xa7），受體親本為華占。在白葉枯病抗性接種鑒定中，以金剛30 作為感病對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 多態性標記的篩選

參照BLAIR 等[4-5]對抗病基因的定位結果，并結合www.gramene.org 上的分子標記整合圖，分別搜索與抗病基因xa5 和Xa7 緊密連鎖的SSR 標記，在供體親本和受體親本之間進行多態性檢測，各篩選到1 對緊密連鎖標記，分別為RM603 與RM20595。

1.2.2 白葉枯病抗性接種鑒定

接種用菌株分別為PXO99（P6）、CR1、ZHE173、CR6 和OS-225。PXO99 來自菲律賓，其他均由本實驗室保存。

在復合雜交分離時代，僅用浙173 菌株接種。改良株系及親本，用上述5 個菌株分別接種鑒定。

采用剪葉接種法接種病原菌，一般在接種后14～21 d 進行調查，每次3～5 張葉片。參考國際水稻研究所標準記載病情[6]。

1.2.3 農藝性狀調查

表1 水稻品種成株期白葉枯病抗性鑒定

圖1 RM603 檢測 華占/ IRBB5//華占///華占的復交BC1F1

圖2 利用RM20595 檢測華占/鎮084//華占///華占的復交BC1F1

表2 水稻品種成株期白葉枯病抗性鑒定

華占及其改良株系B3 種植于中國水稻研究所富陽試驗基地。每個小區種植6 行，每行種6 株，栽插規格為20.0 cm ×23.1 cm 。成熟期各小區材料隨機取5株，在室內考察農藝性狀，主要包括全生育期、株高、單株有效穗數、平均穗長、每穗總粒數、每穗實粒數、結實率和千粒重等指標，重復3 次。

2 結果與分析

2.1 親本的白葉枯病抗性鑒定

水稻分蘗盛期至孕穗初期，在傍晚太陽西斜后，用剪葉法接種4 個水稻品種。成株期的鑒定結果表明，華占對菌種CR1 表現中抗，對其余4 個菌種表現感病或高感，有必要進行抗性改良。IRBB5 和鎮084 對菌株PXO99 表現為高感，感病對照金剛30 對5 個菌株均表現感?。ū?）。

2.2 華占的改良系的選育及標記輔助選擇

以華占為母本，分別與含有Xa7 和xa5 基因的品系鎮084 和IRBB5 進行雜交，然后再分別與華占回交2 次，回交過程中用標記RM603 與RM20595 輔助選擇（圖1、圖2）。

在BC2F1世代，兩個回交方向分別選擇帶有抗性基因的單株進行復合雜交，在復合雜交F2世代，用標記RM603 與RM20595 進行輔助篩選，同時接種白葉枯菌浙173，鑒定白葉枯病抗性。選擇農藝性狀與華占相似的，抗浙173 菌株的材料，進行3～4 代的自交，最終獲得了3 個穩定純合的株系：B1（xa5）、B2（Xa7）和B3（xa5+Xa7）。

2.3 改良株系的白葉枯病抗性評價

在水稻孕穗期用5 個菌種對改良株系進行白葉枯病抗性鑒定。結果表明，感病對照金剛30 對5 個菌系表現為感病或高感，表明接菌反應穩定，各菌株致病力正常；僅攜帶xa5 或Xa7 基因的改良株系B1 和B2 對菌株PXO99 均表現為高感，對其他4 個菌株都表現為抗或高抗；攜有xa5+Xa7 基因的株系B3 對PXO99 表現為中感，對其他4 個菌株都表現為高抗，抗性水平明顯好于僅攜帶單基因的B1 和B2（表2）。

2.4 改良株系B3 的主要農藝性狀

從表3 可見，改良株系B3 在生育期、穗長、千粒重方面與華占相比差異不顯著；每穗總粒數和每穗實粒數均比華占多，其中每穗總粒數差異顯著；單株有效穗數比華占少，差異極顯著?？梢?，改良株系B3 基本保持了華占的優良性狀，白葉枯病的抗性卻明顯提高，在今后可以作為良好的育種材料加以應用。

3 討論

3.1 本研究改良的雜交稻親本的應用前景

由于華占具有配合力好、抗稻瘟病和米質優等特點，將其改造成抗白葉枯病的新品系，對培育生產上大面積推廣的新組合非常有意義。目前正用大量的不育系進行測配，測配組合初步用浙173 菌株進行鑒定，表現為高抗。同時，本研究育成的一些抗白葉枯病中間材料，將是選育新的抗病恢復系的重要供體親本。

3.2 初探聚合基因的選擇

研究表明，抗性基因xa5 和Xa7 對應于病原菌中的無毒基因分別為avrxa5（avirulence, avr）和avrXa7。avrxa5 和avrXa7 均屬于avrBs3/pthA 家族基因，前者102bp 的保守序列在基因內重復19.5 次，后者則重復25.5 次。無毒基因中重復結構域的交換試驗表明，xa5和Xa7 只能分別識別病原菌中的avrxa5 和avrXa7，表現特異的抗病性[7]。

表3 改良株系B3 與華占主要農藝性狀比較

xa5 和Xa7 均為廣譜抗性基因，僅當病原菌中的avrxa5 和avrXa7 同時發生變異或兩者重組產生一個新的致病型才能使聚合了xa5 和Xa7 的水稻品種喪失抗性。因此，聚合xa5 和Xa7 的水稻品系具有延緩品種抗性喪失的作用。