大黃素對高脂血癥斑馬魚脂質代謝的作用研究

王 成，代旭陽，龔莉虹，余琳媛，胡乃華，李蕓霞

成都中醫藥大學藥學院 教育部中藥材標準化重點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都611137

近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食習慣的改變，高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)已逐漸成為危害人類健康的“第一殺手”。在古代，雖沒有對“HLP”的明確記載，但早在《黃帝內經》中已有關于“脂”的描述，如“脂者”、“脂膜”、“油脂”等，甚至還用“膏人”、“肥人”等詞來形容血脂過高的人[1]。古代中醫認為，HLP是臟腑的運輸、疏泄、宣發等生理功能失調而引起的，致使體內津液集聚，痰濕化生，流注經脈，滲入血中[2]?，F代醫學認為，HLP是由于血液中血膽固醇(total cholesterol,TC)和/或甘油三酯(triglyceride,TG)水平異常升高而引起的一種的脂質代謝紊亂[3]，主要分為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥和混合性高脂血癥[4]。目前對于HLP的治療首選他汀類藥物，但隨著長時間的服用，其以轉氨酶升高為特征的肝損害和以肌酸激酶升高為特征的橫紋機溶解等副作用也逐漸凸顯出來。然而，一些天然產物，特別是我國具有高效低毒的傳統降脂中藥，因具有多靶點、多途徑和多環節的作用而受到了格外的關注。因此，本研究將探討其毒副作用很小的大黃素對脂質代謝紊亂的改善作用。

大黃素(1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone,emodin)是一種天然的橙黃色長針狀結晶的游離蒽醌衍生物，廣泛存在于何首烏、大黃、虎杖、蘆薈等中藥材中。目前，大黃素已被證明具有廣泛的藥理作用，如抗炎[5]、抗癌[6]、抗菌、保肝、抗糖尿病、抗骨質疏松、抗血小板聚集以及神經保護[7]等作用。近年來，隨著人們對大黃素的深入研究，越來越多的文獻報道，大黃素還具有降脂、抗氧化應激和抗AS等作用，并且大量研究已經證實大黃素可作為治療HLP和AS的有效物質基礎。Fan等[8]通過高脂飲食誘導金黃地鼠來研究大黃素對脂質代謝紊亂的作用。結果表明，給予大黃素治療28天后，血中TC、TG、LDL-c水平顯著降低，通過繪制脂蛋白譜和核磁共振代謝組學研究，成功發現大黃素可調節血清脂蛋白亞型的分布、調節高密度脂蛋白脂質運載能力和改善血漿內源性分子的代謝輪廓，提示大黃素具有改善高脂血癥金黃地鼠的脂代謝紊亂的作用。

圖2 喂養方案的實驗大綱Fig.2 Experimental outline of the feeding protocol.

HLP的預防和治療已成為亟待解決的難題之一，而對于研發高效低毒的降脂中藥是需要一個合適的模型來進行研究。目前國內外常用于研究與脂質代謝相關的動物主要有大鼠、小鼠、家兔、豚鼠和金黃地鼠等[9]，但近年來，隨著一種新型模式生物—斑馬魚的興起，用它作為藥物篩選的模型被人們廣為接受。斑馬魚是一種原產于南亞地區的熱帶硬骨魚，因其基因組序列與人類有著87%的高度相似性[10]，體積小，胚胎透明，易于大規模飼養，繁殖能力強和實驗周期短，被廣泛作為高通量篩選藥物的經典模型[11]。又因其血脂構成、脂質吸收、脂質代謝、器官和組織與人類基本一致，近年來被大量應用在與脂質代謝和脂質異常相關的疾病研究中，如HLP、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、脂肪肝(fatty liver disease,FLD)、糖尿病(diabetes mellitus,DM)等，是研究單體中藥降血脂作用的理想模式生物[12]。根據課題組前期對大黃素最大耐受濃度(maximum tolerated concentration,MTC)的摸索[13]，發現大黃素在斑馬魚幼魚上的MTC為0.73 μg/mL，隨后以0.1 μg/mL的等梯度濃度進行預實驗，發現大黃素濃度在0.1～0.5 μg/mL對斑馬魚脂代謝紊亂有改善作用，所以最終選擇了0.125、0.25、0.5 μg/mL的大黃素作為后續實驗的低、中、高濃度。因此，本文通過復制HLP的斑馬魚為模型生物，研究大黃素對HLP斑馬魚脂質代謝的作用，以期為HLP的相關機制研究和大黃素的開發利用提供新的思路。

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗動物

野生型AB品系斑馬魚由成都中醫藥大學藥學院斑馬魚實驗室提供，轉基因血管熒光斑馬魚Tg(fli1:eGFP)購于國家斑馬魚資源中心。所有成年斑馬魚在北京愛生公司斑馬魚養殖系統中養殖，水溫28 ℃，pH值7.4，電導率400～600 μs/cm。每日喂養兩次，日光燈照射14 h，黑暗環境10 h。其余飼養和繁殖條件參照Zebrafish Book。斑馬魚的實驗遵循成都中醫藥大學動物保護協會和使用委員會的要求。欲得實驗所需的斑馬魚仔魚，于實驗開始前1天下午，選用健康性成熟的雌雄斑馬魚，按照♀∶♂=1∶1～2的數量移入產卵盒，并用透明隔板將雌雄斑馬魚隔開，于次日9時移去隔板，待雄魚追逐雌魚1 h后收集胚胎。收集到的胚胎用培養液清洗干凈后移入無菌培養皿，放置于28 ℃恒溫培養箱中，每天更換清潔水。待受精卵孵育至5 dpf(days post fertilization)，挑選出健康的個體進行后續實驗。

1.2 實驗試藥

大黃素購于成都曼思特生物科技有限公司，批號為MUST-18110810，純度為98.73%。

1.3 實驗試劑

斑馬魚幼魚飼料(邰港科技股份有限公司，批號為20171115)；膽固醇(美國Amresco公司，批號為57-88-5)；Cholesteryl BODIPY?542/563 C11(美國Thermo scientific公司，批號為2000227)；TC、TG、LDL-c、HDL-c測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20190322、20190322、20190321、20190321)；無水乙醚(成都市科龍化工試劑廠，批號為20110117)；二甲基亞砜(廣州賽國生物科技公司，批號為EZ1609C224)；無水乙醇(四川西隴科學有限公司，批號為180904)等。

1.4 實驗儀器

Olympus激光共聚焦顯微鏡(FV-OSR型，日本奧林巴斯公司)；酶標儀(Multiskan Mk3型，美國Thermo scientific公司)；電子分析托盤天平(Sartorius 11D型，德國Sartorius公司)；離心機(ALLEGER X-12型，美國BECKMAN Coulter公司)；渦旋震蕩器(BP-2 Vortex-Genie 2型，美國Scientific Industries公司)等。

2 實驗方法

2.1 飼料配制

2.1.1 高膽固醇飼料的配制

將普通斑馬魚幼魚飼料浸沒于溶解有一定量膽固醇的無水乙醚中，充分攪拌至乙醚完全揮發，使膽固醇附于普通飼料上，制備成含4%(w/w)的高膽固醇飼料[14]。

2.1.2 熒光探針飼料的配制

將熒光探針(熒光標記的膽固醇乙脂類似物：Cholesteryl BODIPY?542/563 C11)溶解于無水乙醚中，按照10 μg/g的比例，分別添加到普通飼料和高膽固醇飼料中即可。由于熒光標針對光比較敏感，所以此飼料的配制應盡可能在黑暗的環境中操作。

2.2 斑馬魚分組及給藥方案

為了獲得斑馬魚幼魚的活體成像圖片，待胚胎發育至20 hpf時以及之后的整個實驗周期中，在飼養用水中添加0.03 g/L的1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea,PTU)，以抑制斑馬魚胚胎中黑色素的生成。每日定時更換新鮮的PTU培養水，并及時將死卵和卵殼清除。待Tg(fli1:eGFP)受精卵孵育至5 dpf時，挑選出健康的個體，隨機分為普通飼料組(normal cholesterol diet,NCD)，高膽固醇飼料組(high cholesterol diet,HCD)，大黃素低、中、高劑量組(Emo-L、Emo-M、Emo-H組)，于6孔板中飼養，每孔50尾仔魚，每組設置3個復孔。正常對照組飼喂添加有熒光探針的普通飼料，高膽固醇模型組飼喂添加有熒光探針的高膽固醇飼料，給藥組飼喂添加有熒光探針的高膽固醇飼料且在每天早上分別加入不同濃度的大黃素，即Emo-L、Emo-M和Emo-H組分別添加0.125、0.25、0.5 μg/mL的大黃素。各組斑馬魚每天定時定量投喂飼料2次，定時換水1次，連續喂養10天。

2.3 存活率觀測

分別于造模給藥后10天內，觀察并記錄各組斑馬魚的存活尾數，計算其百分率。

2.4 體重、體長和體質量指數(body mass index,BMI)測量

用三卡因溶液將幼魚麻醉，用吸水紙將幼魚表面水吸干，在分析天平中稱量各組斑馬魚的體重并記錄。用游標卡尺測量幼魚頭部最前端到魚尾最末端距離，這段長度代表幼魚體長，BMI為體質量(mg)除以體長(cm)的平方所得的數值。

2.5 斑馬魚幼魚血管膽固醇含量測定

實驗結束后，從每組中隨機取8尾幼魚，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察膽固醇在斑馬魚幼魚血管中的積累情況并拍照。為了保證斑馬魚在拍攝過程中是存活的，需要將斑馬魚幼魚麻醉并固定在含有0.02%三卡因的0.5%低熔點瓊脂糖中。顯微拍攝時，以斑馬魚幼魚血管處的的泄殖腔為左側邊界，放大100倍。拍攝的所有照片均設置相同的參數，以便后續對熒光的強度進行定量分析。

2.6 斑馬魚幼魚脂質代謝生化指標測定

在實驗終止階段，將每組30尾斑馬魚長時間暴露在高濃度的三卡因溶液中至安樂死，并將動物腹中未消化的食物清除。將斑馬魚幼魚按體質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍量體積的無水乙醇，在冰水浴條件下機械勻漿，2 500 rpm，離心10 min，吸取上清液，按照TC、TG、LDL-c和HDL-c試劑盒說明書，測量幼魚體內總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的濃度。

2.7 斑馬魚幼魚動脈粥樣硬化指數的測定

根據每組計算出來的幼魚體內的總膽固醇濃度和高密度脂蛋白膽固醇濃度，利用以下公式，計算出各組斑馬魚幼魚的動脈粥樣硬化指數。

動脈粥樣硬化指數(AI)=(TC-HDL-c)/HDL-c

2.8 圖像分析

各組斑馬魚幼魚均在Olympus激光共聚焦顯微鏡下成像。紅色通道：559 nm，綠色通道：488 nm，并利用奧林巴斯自帶的圖像分析軟件對斑馬魚幼魚尾動脈的平均熒光密度(mean fluorescence intensity,MFI)進行分析。

2.9 數據統計與分析

3 實驗結果

3.1 存活率觀測

對不同組別斑馬魚幼魚生長和死亡情況進行分析，可以看出NCD組生長正常，體表色素正常，基本無死亡。HCD組，因連續飼喂10天高膽固醇飼料，致使該組死亡率上升。給藥組死亡率明顯低于HCD組，活動度增強。各組存活率如圖3所示，與NCD組相比，HCD組幼魚存活率極顯著性降低(P<0.001)；與HCD組相比，Emo-L組幼魚存活率顯著性升高(P<0.01)；Emo-M組、Emo-H組幼魚存活率均極顯著性升高(P<0.001)。

圖3 不同濃度的大黃素對高膽固醇血癥斑馬 魚存活率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of emodin on survival rate in hypercholesterolemic zebrafish 注：與NCD組比較，###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P< 0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3.2 體重、體長和BMI測定

如表1所示，與NCD組相比，HCD組幼魚體重、體長極顯著性增加(P<0.01)；與HCD組相比，Emo-L組、Emo-M組、Emo-H組幼魚的體重、體長均極顯著性降低(P<0.01)，且Emo-H組幼魚的BMI與NCD組有極顯著性差異(P<0.01)。

表1 各組斑馬魚幼魚喂養10天后體重、體長、BMI變化Table 1 Changes in body weight,body length and BMI of zebrafish larvae after 10 days of feeding in each

注：與NCD組比較，##P<0.01，###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,##P<0.01,###P<0.001; Compared with the HCD group,**P<0.01,***P<0.001.

3.3 大黃素對斑馬魚幼魚血管膽固醇積累的影響

如圖4、圖5和表2所示，利用高膽固醇-熒光探針飼料連續喂食斑馬魚幼魚10 d后，與NCD組相比，HCD組幼魚血管中膽固醇水平升高7.46倍(P<0.001)。結果表明可以利用高膽固醇-熒光探針飼料飼喂斑馬魚幼魚來進一步研究體內膽固醇的積累情況。不同濃度大黃素處理10天后，與HCD組相比，Emo-L組，Emo-M組和Emo-H組分別降低血管膽固醇18.57%(P<0.01)，49.21%(P<0.001)，73.53%(P<0.001)。結果表明大黃素對高膽固醇誘導的高膽固醇血癥斑馬魚幼魚血管膽固醇含量有一定的改善作用。

圖4 大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚血管膽固醇累積的影響(×100)Fig.4 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(×100) 注：A：Fli1:eGFP斑馬魚幼魚熒光圖。箭頭：尾動脈，三角：泄殖腔。熒光密度測量從泄殖腔開始，也就是矩形所標記的位置。綠色熒光為血管，紅色熒光為磷脂標記的膽固醇，綠色通道：488 nm，紅色通道：559 nm。B：各組斑馬魚幼魚血管脂質堆積情況。斑馬魚幼魚尾動脈熒光密度圖，側面視圖，背部朝上。紅色熒光為磷脂標記的膽固醇，紅色通道：559 nm。Note: A: Fluorescent image of Tg (fli1:eGFP) zebrafish larvae.Arrow: caudal artery; triangle: cloaca.Fluorescence intensity was measured from the cloacal,the position marked by the rectangle.Blood vessel is shown green fluorescence and while lipid (cholesterol) is in red.Green channel: 488 nm; Red: 559 nm.B: Lipid accumulation in blood vessels of zebrafish larvae in each group.Fluorescence images of the artery were shown from tested groups in zebrafish larvae.Lateral views,dorsal is up.The red fluorescence is the phospholipid labeled cholesterol.Red: 559 nm.

表2 大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚血管膽固醇累積的影響Table 2 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(n=

注：與NCD組比較，###P<0.001；與HCD組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

3.4 大黃素對斑馬魚幼魚TC、TG、LDL-c和HDL-c的影響

如表3所示，與NCD組相比，HCD組幼魚TC、TG、LDL-c和HDL-c水平均極顯著性升高(P<0.01)；與HCD組相比，Emo-L組幼魚的TC和LDL-c水平分別下調24.28%(P<0.001)，44.89%(P<0.01)，HDL-c水平上升188.46%(P<0.05)，TG水平變化不顯著；Emo-M組幼魚的TC和LDL-c水平分別下調30.76%(P<0.001)，51.39%(P<0.01)，HDL-c水平上升334.62%(P<0.001)，TG水平變化不顯著；Emo-H組幼魚的TC、TG和LDL-c水平分別下調39.90%(P<0.001)，56.23%(P<0.01)，51.39%(P<0.01)，HDL-c水平上升403.85%(P<0.001)。結果表明大黃素具有一定的降血脂和降膽固醇作用。

圖5 大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚血管 膽固醇累積的影響(n= 8)Fig.5 Effects of emodin on vascular cholesterol accumulation in hypercholesterolemic zebrafish(n= 8) 注：與NCD組比較， ###P<0.001；與HCD組比較，**P<0.01，***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P< 0.001; Compared with the HCD group,**P<0.01,***P<0.001.

3.5 動脈粥樣硬化指數

如圖4所示，與NCD組相比，HCD組幼魚AI極顯著性升高(P<0.001)；與HCD組相比，Emo-L組，Emo-M組和Emo-H組幼魚的AI均極顯著性降低(P<0.001)。結果表明，大黃素能降低高膽固醇血癥斑馬魚的動脈粥樣硬化指數。

表3 大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚TC、TG、LDL-c和HDL-c的影響Table 3 Effects of emodin on TC,TG,LDL-c and HDL-c in hypercholesterolemic 30)

注：與NCD組比較，##P<0.01，###P<0.001；與HCD組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

Note: Compared with the NCD group,##P<0.01,###P<0.001; Compared with the HCD group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.

圖6 大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚動脈 粥樣硬化指數的影響(n = 30)Fig.6 Effect of emodin on atherosclerosis index in hypercholesterolemic zebrafish(n = 30) 注：與NCD組比較,###P<0.001；與HCD組比較,***P<0.001。Note: Compared with the NCD group,###P<0.001; Compared with the HCD group,***P<0.001.

4 討論

隨著飲食結構和交通方式的轉變，HLP的發病率呈逐年上升趨勢。長期高脂高膽固醇飲食會打破機體脂質吸收和消化之間的平衡關系，導致脂肪和膽固醇在血管內壁上過度沉積，形成粥樣斑塊，影響血流速度，進而產生一系列更為嚴重的心血管疾病。有研究表明，HLP是導致FLD、AS、DM、冠心病、腦梗死等多種疾病的首要病因。因此，及早進行預防和選用有效的降脂藥是降低患者心血管事件發生的有效控制手段。開發和研究具有降脂作用的中藥需要建立可靠的脂質代謝紊亂動物模型，目前國內外主要用豚鼠和金黃地鼠兩種動物來建立HLP模型研究血脂代謝相關疾病[15]，因其具有成本低、造模時間短等優點。隨著新理論、新技術和新概念的出現，人們對高脂模型的要求隨之提高。研究人員在進行研究時必須謹慎，因為某些模型的脂質代謝可能被證明與人類完全不同，因此就可能不適合用于篩選降血脂中藥。目前，一種可以高通量篩選藥物的生物模型—斑馬魚，因其具有身體透明、器官清晰可見和能夠以高分辨率在體內對器官和生物過程進行非侵入性的可視化等優點，被人們廣泛關注和使用。

Stoletov等[14]利用其上述特性，對活體高膽固醇血癥斑馬魚幼魚的血管脂質堆積、脂蛋白氧化和脂肪條紋的形成情況進行了實時的研究報道。因此，本研究通過飼喂斑馬魚幼魚高膽固醇-熒光探針飼料(添加Cholesteryl BODIPY?542/563 C11)來復制HLP模型，在共聚焦顯微鏡下觀察被標記的膽固醇(顯微鏡下表現為紅色熒光)在斑馬魚幼魚血管處的累積，進而研究大黃素對HLP斑馬魚脂質代謝紊亂的改善作用。研究結果表明，斑馬魚給予高膽固醇飼料10天后，幼魚血管中膽固醇水平極顯著升高，且大量沉積在血管附近，用不同濃度的大黃素處理10天后，幼魚血管中膽固醇水平均極顯著降低，減輕了膽固醇在血管附近的堆積，提示大黃素對高膽固醇血癥斑馬魚幼魚血管膽固醇含量和沉積有一定的改善作用。

目前臨床上常用TC、TG、LDL-c和HDL-c作為檢測HLP基本的指標。因此，本研究測定了這四種脂質水平，結果顯示，斑馬魚給予高膽固醇飼料10天后，幼魚體內的TC、TG和LDL-c水平均極顯著性升高，HDL-c水平極顯著性降低，表明通過給予高膽固醇飼料來復制HLP斑馬魚模型是可行的。用不同濃度的大黃素處理10天后，除TG水平變化不顯著外，其余指標水平均有顯著性差異，且呈劑量依耐性，提示在一定濃度范圍內的大黃素對脂質代謝紊亂有較好的改善作用。脂質、膽固醇和復合糖類長期大量的在血管處集聚、沉著，會導致動脈壁增厚變硬、血管腔變窄，致使動脈內膜出現黃色的粥樣，進而演變成AS。血清TC和LDL-c水平升高是AS發生的重要危險因素。目前，國際醫學界常用動脈粥樣硬化指數來衡量動脈硬化的程度，可以通過TC和HDL-c水平計算出動脈粥樣硬化指數。雖然現在對正常斑馬魚還沒有確定的動脈粥樣硬化指數標準，但通過本研究可以發現，當給予高膽固醇飼料10天后，AI較正常組極顯著的升高，用不同濃度的大黃素后，其AI均顯著性降低，表明大黃素在抗AS方面表現出極好的作用。

綜上所述，本研究發現大黃素能顯著改善HLP斑馬魚的體脂水平，對HLP有較好的改善作用，以期為HLP的相關機制研究和大黃素的開發利用提供新的思路，后續還應對其發揮良好調脂作用的具體機制進行更深入的研究。