紫蘇葉揮發油舒張血管作用及其活性物質探究

周勤梅，譙明鳴，彭 成*，敖 慧，熊 亮*，劉 菲

1成都中醫藥大學藥學院 教育部中藥材標準化重點實驗室 西南特色中藥資源國家重點實驗室；2成都中醫藥大學，西南特色藥材創新藥物成分研究所，成都611137

紫蘇葉來源于唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥葉(或帶嫩枝)。在我國應用歷史悠久，具有解表散寒，行氣和胃的傳統功效，常用于風寒感冒，咳嗽嘔惡，妊娠嘔吐，魚蟹中毒等[1]。由于氣味芳香，也常作為香精和調料使用[2,3]，紫蘇葉揮發油含量高，約0.2%～1.5%[3]，《中國藥典》2015年版中規定藥材含揮發油不得少于0.40%。

紫蘇全身是寶，其葉、梗、籽都可以藥食兩用，有助于預防心血管疾病[4]。紫蘇子壓榨的植物油富含α-亞麻酸，具有調脂、抗動脈硬化作用，對降低心腦血管疾病具有積極意義[5]，從而備受人們親睞。同樣，紫蘇葉作為重要的食材，生活中應用頗廣，現代藥理研究主要集中于其揮發油具有明顯的抗病原微生物、抗過敏、抗炎、抗氧化等作用[6-9]，而對于心血管疾病方面的研究鮮有報道。本研究開展了紫蘇油舒張血管活性及其活性物質研究，為紫蘇葉的應用和推廣提供科學內涵。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

肌張力傳感器：JH-2型，中國北京航天醫學工程研究所；離體組織器官恒溫灌流系統：埃德儀器國際貿易(上海)有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent 7890A/5975C氣相色譜/質譜聯用儀；電子分析天平：Sartorius系列，型號BP221S型；優普超純水制造系統，型號UPT-II-20T，成都超純科技有限公司；可調式移液器：Thermo Fisher Scinentific。

紫蘇葉藥材于2017年6月購自于四川省新荷花飲片公司，經成都中醫藥大學高繼海副教授鑒定為紫蘇Perillafrutescens的干燥葉。紫蘇醛標準品(純度≥98%)，由成都化夏化學試劑有限公司提供，批號：253466。Acetycholine chloride：Bomei；二甲亞砜(DMSO)：成都科龍試劑廠，分析純，批號：2015110201；NaCl，KCl，KH2PO4，MgSO4，NaHCO3，Glucose，EDTA，CaCl2均為分析純，購自成都科隆化學品有限公司。

1.2 實驗動物

SD大鼠，清潔級，雌雄不限，體重200±20 g，由成都中醫藥大學實驗動物研究中心提供。動物生產許可證號：SCXK(川)2013-24，檢疫后用。飼養溫度21～27 ℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風環境自然調節。

1.3 揮發油的提取

取紫蘇葉藥材500 g，參照《中國藥典》2015年版紫蘇葉項下揮發油提取方法[1](水蒸氣蒸餾法)得到紫蘇葉揮發油2.2 mL，經無水硫酸鈉干燥除水后，貯存于4 ℃冰箱，備用。

1.4 舒張血管活性篩選

1.4.1 溶液的配制

K-H溶液配制：稱取NaCl 6.92 g，KCl 0.35 g，KH2PO40.16 g，MgSO40.14 g，NaHCO32.1 g，Glucose 1.82 g，EDTA 0.009 g，CaCl20.28 g，加入純水，溶解并定容于1 000 mL量瓶中，現用現配。

樣品溶液的配制：精密稱取紫蘇油適量，加二甲基亞砜配制成40 mg/mL的母液，備用。實驗中采取累積給藥方式，加入K-H溶液的浴槽中，使其在浴槽中的終濃度分別0.2、0.7、2、7、20 μg/mL。實驗中其他若非特別說明，則以去離子水為溶劑。

1.4.2 大鼠胸主動脈血管環的制備

大鼠脫頸椎處死，迅速打開胸腔，快速取出胸主動脈，并置于O2飽和4 ℃ K-H液(pH=7.4)中，剔除周圍的結締組織，沖洗血管內血液，剪成3～5 mm的血管環。血管環用兩根不銹鋼蹬型掛鉤水平懸掛于浴管內，一端固定于浴管內，另一端連接張力換能器，調節1 g的基礎張力，采用離體組織灌流模型和PowerLab數據分析系統采集和記錄離體血管環張力的變化。浴槽內含有K-H液，溫度恒定在37 ℃，持續通95%O2+5%CO2混合氣體，平衡60 min，每15 min換37 ℃ K-H液。

1.4.3 血管環活性檢測

在開始實驗前，采用KCl(60 mmol/L)預收縮血管環，當收縮張力達到坪值后，往浴槽內加入Ach(10 μmol/L)舒張血管環，連續刺激3次。每次刺激后，K-H液連續沖洗三次，每次5 min，恢復到基礎狀態后，穩定30 min。當連續的兩次收縮或舒張幅度小于10%，認為血管環組織結構完整，血管環活性良好，可重復實驗。

1.4.4 紫蘇葉油以及單體化合物對KCl收縮曲線影響檢測

待血管環平衡60 min后，用KCl(60 mmol/L)連續刺激血管環至少2～3次。每次刺激后，K-H液連續沖洗三次，每次5 min，恢復到基礎狀態后，穩定30 min。當連續相同刺激所引起的血管收縮幅度小于10%，往浴槽內加入KCl(60 mmol/L)預收縮胸主動脈環，血管收縮張力達到坪值時，累積加入5個濃度的紫蘇葉揮發油，觀察濃度與舒張效應曲線，比較不同濃度下紫蘇葉揮發油對KCl(60 mmol/L)預收縮血管環的舒張作用。同法，對單體化合物紫蘇醛(依次為0.5、1.5、5、15、50 μmol/L)進行活性篩選，比較不同濃度下對KCl(60 mmol/L)預收縮血管環的影響。

1.4.5 數據統計

以KCl(60 mmol/L)所致的最大收縮張力為100%，計算各濃度揮發油所致的舒張百分比(%)。采用血管張力值變化反映藥物的舒張作用，單位為g。實驗數據以mean±SEM表示(n=6)，組間比較采用t檢驗，SPSS 18.0統計完成(P<0.05，有顯著性差異；P<0.01，有極顯著性差異)。化合物的濃度依賴舒張效應曲線圖采用Graphpad Prism 5軟件完成(以不同給藥濃度下最大舒張率為縱坐標，累積給藥濃度的對數值為橫坐標)。

1.5 GC-MS分析

為進一步分析紫蘇油發揮抗血管生成活性的物質組成，本實驗采用了氣質聯用技術(GC-MS)對其進行分析。方法參照氣相色譜法(中國藥典2015版二部附錄V E)測定。

1.5.1 色譜條件

色譜柱為HP-5 MS型石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱流量1.0 ml/min，載氣為高純度氦氣(99.999%)，柱前壓7.65 psi。程序升溫：初始溫度60 ℃，以每分鐘10 ℃的速率升溫至90 ℃，以每分鐘2 ℃的速率升溫至180 ℃，進樣口溫度280 ℃，分流比20∶1。離子源為EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，發射電流34.6 μA，質量范圍20～800 amu。

1.5.2 GC-MS數據處理

通過Agilent 5975C MSD化學工作站檢索Nist 14.0標準質譜圖庫，同時結合有關質譜圖文獻解析，對紫蘇葉油中的化學成分進行鑒定。通過Agilent 5975C MSD化學工作站數據處理系統，按峰面積歸一化法計算求出各化學成分的峰面積相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 紫蘇葉油對KCl預收縮血管環的影響

實驗中以DMSO為空白溶劑，可以看出其對血管舒張無明顯影響(見圖1)。本實驗選擇Methoxyverapamil作為KCl誘導血管環收縮模型的陽性對照藥，維拉帕米(verapamil)是常見的治療高血壓、心率失常、心絞痛的藥物，其作用機制為阻斷鈣離子通道[10-11]，觀察其對KCl誘導血管環收縮張力的影響。按照累積給藥方式，Methoxyverapamil對KCl誘導血管環收模型具有明顯的舒張作用，EC50為0.69 μmol/L。

紫蘇葉揮發油對KCl預收縮的離體大鼠胸主動脈環具有良好的舒張作用，在0.2～20 μg/mL劑量范圍內呈依賴性，其EC50為8.6 μg/mL。KCl通過高K+去極化，使細胞膜上的VDCCs開放，外鈣內流，細胞內游離Ca2+濃度升高，血管平滑肌出現收縮[12]。因此紫蘇葉揮發油舒張血管作用可能是通過影響KCl導致的VDCCs開放，減少胞外Ca2+的內流而實現。

圖1 空白溶劑、陽性藥以及紫蘇葉揮發油對KCl預收縮胸主動脈環的舒張量效曲線Fig.1 Vasorelaxant activity of solvent,methoxyverapamil and the volatile oil against KCl-induced 注：與空白溶劑組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

2.2 紫蘇油活性部位的化學組成

采用GC-MS對紫蘇揮發油進行分析，發現水蒸氣蒸餾法提取的紫蘇葉揮發油含量及主要成分相對百分含量見表1；按上述色譜條件進樣得到揮發油的總離子流色譜圖見圖2。

表1 紫蘇葉揮發油化學成分及其相對百分含量Table 1 Chemical constituents and relative percentages of volatile oil from Perilla leaves

續表1(Continued Tab.1)

峰號No.保留時間tR(min)化合物Compound分子式Molecular formula分子量Molecular weight相對百分含量Relative percentage (%)49.706香薷酮 Elsholtzia ketoneC10H14O21662.70510.583未鑒定 Unknown--0.57611.6501-(呋喃-2-基)-4-甲基戊-1-酮 1-(Furan-2-yl)-4-methylpentan-1-oneC10H14O216622.18712.744紫蘇醛 PerillaldehydeC10H14O15037.15813.480未鑒定 Unknown--1.13913.865未鑒定 Unknown--10.661019.320石竹烯 CaryophylleneC15H242045.971121.032α-律草烯 α-HumuleneC15H242040.591223.4532,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環[3.1.1]庚-2-烯2,6-Dimethyl-6-(4-methyl-3-pentenyl)bicyclo[3.1.1]hept-2-eneC15H242042.561327.806氧化石竹烯 Caryophyllene oxideC15H24O2202.991429.030未鑒定 Unknown0.461530.516δ-芹子烯 δ-SelineneC15H242040.821631.464β-桉葉醇 β-Eudesmol1.361731.618α-桉葉醇 α-EudesmolC15H26O2221.37

紫蘇由于產地的不同其化學組成存在顯著性差異[13,14]，結合GC-MS法對紫蘇油進行化學組成分析發現，本實驗中的活性部位紫蘇葉油中主要含有單萜和倍半萜類成分，且紫蘇醛為其代表性成分(含量為37.15%)，提示紫蘇油發揮舒張血管活性可能與該成分密切相關。

圖2 紫蘇葉揮發油的總離子流Fig.2 Total ion current chromatography of the volatile oil from Perilla leaves

2.3 主要成分紫蘇醛的舒張血管活性的評價

本實驗進一步選擇紫蘇葉揮發油中的主要代表性單萜紫蘇醛進行研究，觀察其對KCl預收縮胸主動脈環的活性影響，以濃度與效應繪制曲線，結果發現累積給藥加入紫蘇醛，對KCl(60 mmol/L)預收縮血管環的表現出一定的舒張作用，當濃度為50 μmol/L時，最大舒張率為35.3%±8.6%，結果見圖3。

3 結論

揮發油是從植物中提取的揮發性芳香物質。本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取紫蘇葉揮發油，該方法適用于具有芳香性成分(萜類或芳香族類)的提取，與文獻報道一致[13,14]。而來源于該植物的種子紫蘇子因脂肪油含量較高，常采用壓榨法進行提取，其揮發性和芳香性較弱，以α-亞麻酸為代表的脂肪酸類成分常常需要甲酯化后才能進行檢測[15,16]。因此，揮發油提取方法的選擇與藥用部位所含成分的性質密切相關。

目前，大量研究表明植物揮發油對心血管具有明顯的作用[17]。紫蘇葉是藥食同源的，現代藥理研究主要集中在抑菌、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫功能等方面，本研究首次證實紫蘇葉揮發油具有顯著的舒張血管的作用。經GC-MS聯用技術分析該活性部位，發現紫蘇葉油中主要含有單萜類和倍半萜類，提示萜類成分可能是其主要的活性物質。為進一步追蹤藥效物質，本研究選擇含量較高的單萜類成分紫蘇醛(含量為37.15%)進行篩選，結果發現紫蘇醛具有一定的舒張縮血管作用，當濃度為50 μM時，最大舒張率為35.3%，表明紫蘇醛是紫蘇葉油舒張血管的重要活性成分之一。

圖3 紫蘇醛對KCl預收縮胸主動脈環的 舒張量效曲線Fig.3 Vasorelaxant activity of perillaldehyde against 注：與空白溶劑組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。Note:Com- pared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01.

經大量文獻查閱，發現紫蘇葉揮發油中單萜類成分右旋檸檬烯(D-limonene，含量7.86%)和芳樟醇(linalool，含量1.47%)具有舒張血管的作用。二者均是常見的單萜類化合物，其中，右旋檸檬烯是柑橘類(橙，檸檬，金橘和柚子等)精油的主要成分[18]。學者Touvay等[19]研究了右旋檸檬烯對野百合堿(MCT)誘導的大鼠的肺動脈高壓和右心室肥厚的影響，每日口服400 mg/只給藥大鼠，右旋檸檬烯均能顯著降低MCT引起的大鼠肺動脈高壓和右心室肥厚，此外還能降低肺動脈中膜厚度。芳樟醇通常為外消旋混合物，存在于多種草本植物中，在化妝品和食品行業常被用作香水和香料[20]。H?ferl等[21]研究探討芳樟醇對血壓的影響，發現該單萜對人體心血管系統具有明顯的影響。綜上所述，紫蘇葉揮發油發揮舒張血管作用的物質基礎主要是單萜類成分，其顯著的藥效可能與多活性成分的協同作用有關，具體有待進一步研究。