白囊耙齒菌多糖結構及抗腎小球系膜細胞的增殖活性研究

高苗苗， 李士偉， 祝洪艷*，徐多多*

1吉林農業大學 中藥材學院，長春130118；2長春中醫藥大學 吉林省人參研究院，長春130117

多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖、免疫調節等活性[1-4]，且作為藥物毒副作用低，不良反應少,已成為天然藥物及保健品研發中的重要組成部分。白囊耙齒菌 (以下簡稱耙齒菌) 是一種重要的藥用真菌，屬于擔子綱非褶菌目多孔菌科耙齒菌屬，又被叫做白囊孔、耙齒菌。在我國白囊耙齒菌主要分布于吉林省的長白山、黑龍江、河北等省區。耙齒菌發酵物的活性成分為多糖類物質。近年來研究表明，耙齒菌多糖具有抗腫瘤、抗炎等活性[5]。但是，國內外對耙齒菌的研究很少，且多糖類物質的分子量較大，結構非常復雜，因此對耙齒菌多糖的研究相對滯后。本實驗通過分離制備耙齒菌發酵物中不同的多糖片段，得到兩種均一多糖，表征其結構。為耙齒菌多糖結構的系統研究和明確其結構與功能之間的聯系提供了科學依據。耙齒菌多糖粗提取物是吉林省多個藥品生產企業生產的品種--益腎康膠囊的原料，主要用于治療腎小球腎炎引起腰痛、浮腫、尿少、血壓升高等癥。在民間，耙齒菌多糖治療腎炎的應用非常的廣泛。雖然在臨床上治療慢性腎小球腎炎具有良好的應用基礎，但治療腎炎的活性成分及機制卻尚不清楚，相關的國內外對此方面的研究報道也很少，因此，耙齒菌治療腎炎缺乏相應的理論支撐，這一現狀，將會嚴重的限制耙齒菌的在臨床的合理使用，益腎康膠囊也難以確定合理的工藝，無法建立有效的質量控制方法，難以保證其安全性及有效性。為了明確耙齒菌治療慢性腎小球腎炎的有效成分，我們以在腎炎疾病中的發生發展中起到關鍵作用的腎小球系膜細胞(GMC)作為篩選模型，觀察耙齒菌多糖對GMC的異常增殖及FN,LN等相關因子釋放的影響，篩選出活性多糖，為多糖治療慢性腎炎的構效關系這一科學問題，提供有益的借鑒和依據。

1 材料及儀器

耙齒菌固體發酵物，由通化吉通藥業股份有限公司提供。腎小球系膜細胞(ATCC)；PRMI1640培養基(美國 hyclone 公司)；717型陰離子交換樹脂、732型陽離子交換樹脂(上海綠寶樹脂廠)；脂多糖(美國sigma公司)；葡萄糖等單糖標品(美國Sigma公司)；噻唑藍(MTT)(上海碧云天生物試劑有限公司)；胎牛血清FBS(Gibco)；苯酚、濃硫酸、二甲基亞砜、氫氧化鈉，等均為國產分析純。

酶標儀 MK3(Thermo(上海)儀器有限公司)；N1000旋轉蒸發儀(日本東京理化儀器有限公司)；6890N-5973MSD氣-質聯用儀、1100-6320 MS液-質聯用儀(美國Agilent公司)；TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)。

2 方法

2.1 耙齒菌粗多糖的提取

采用多糖傳統的提取方法--水提醇沉法。耙齒菌發酵物，加水加熱使溶解，濾除不溶物，濃縮至一定體積，加入無水乙醇，不斷攪拌，至乙醇濃度為80%，離心，沉淀揮干乙醇后加水溶解。采用Sevage法除去蛋白，離心除去沉淀，上清回收，凍干，即得耙齒菌粗多糖(PC)。

2.2 PC的分離純化

稱取粗多糖30 g，用150 mL水溶解，通過717+732混合床離子交換樹脂純化，收集8個柱體積水洗脫液，濃縮至小體積，干燥，得到PCP。通過 SePhadex G-50凝膠柱分離PCP，分別稱取葡萄糖和藍色葡聚糖對照品10 mg，混合加5 mL蒸餾水溶解，經過上述中壓柱，流速為1 mL/min，每管收集10 mL，隔管以苯酚-硫酸法監測中性糖，以收集的洗脫液的管數為橫坐標，對應的吸光度值作為縱坐標繪制洗脫圖，測定內水(Ve)和外水體積(VO)。稱取PCP20 mg，用5 mL水溶解，經過上述中壓柱，流動相為水，每管收集10 mL。隔管以苯酚-硫酸法監測中性糖，以收集的洗脫液的管數為橫坐標，對應的吸光度值作為縱坐標繪制洗脫圖。按照洗脫圖合并組分，分別得到PCP-1和PCP-2。

2.3 PCP-1、PCP-2理化性質的測定

采用苯酚—硫酸法[6]測定總糖含量，間羥基聯苯法[7]測定酸性糖含量，BCA法[8]測定蛋白含量。

PMP柱前衍生化HPLC法[9]分析組成糖。色譜條件： C18色譜柱(5 μm，250 × 4.6 mm)；柱溫40 ℃；檢測波長250 nm；流速0.8 mL/min；流動相A為0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(KH2PO4-NaOH，PH6.8)-乙腈(85∶15)，流動相B為0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶(KH2PO4-NaOH，PH6.8)-乙腈(60∶40)。

2.4 PCP-1、PCP-2分子量測定

采用高效凝膠分子排阻色譜法[10]測定PCP-1、PCP-2分子量。

色譜條件：色譜柱為Shodex OhPak SB-802.5 HQ(8 mm×300 mm)凝膠柱，流動相為0.7%硫酸鈉溶液，柱溫35 ℃，流速為0.5 mL/min，進樣量20 μL，示差折光檢測器。

2.5 耙齒菌多糖PCP-1和PCP-2的化學結構的研究

2.5.1 PCP-1、PCP-2的IR分析

IR是多糖結構分析的一種輔助手段，主要用于確定苷鍵的構型，觀察特征的官能團。PCP-1、PCP-2經KBr壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描，得IR 光譜圖。

2.5.2 甲基化

甲基化是多糖結構研究中非常重要的一種手段。它可以提供多種信息，如糖殘基的種類及各糖殘基的數目。本實驗采用改良的Hakomori法，該方法以DMSO 為溶劑，用DMSO 與NaOH的反應產物甲基亞磺酰負離子 CH3SOCH2-為強堿，因CH3SOCH2-易與氧、水或二氧化碳反應而降解，所以整個過程應在氮氣保護和無水條件下進行。將樣品PCP-1和PCP-2進行甲基化[11]。經甲基化，水解還原乙?；玫讲糠旨谆奶谴家宜狨パ苌铮M行GC-MS分析。

分析條件：DB-1 MS石英毛細管柱(30 m×0.32 mm)，進樣口溫度為200 ℃，離子源溫度為250 ℃。升溫程序：140 ℃保持7.5 min，以2 ℃/min程序升溫至250 ℃，保持20 min。流速為1 mL/min，進樣量1 μL，分流比為50∶1。

2.6 耙齒菌多糖抗GMC增殖活性

2.6.1 建立LPS誘導GMC細胞增殖的模型

取GMC細胞種于96孔培養板中，調細胞濃度為1×105個/mL，接種24 h后，細胞貼壁，此時將培養液吸出，用無血清的培養基繼續培養24 h，使細胞同步于G0期。采用不同濃度的LPS培養不同的時間考察細胞的增殖。按照以下方式分組:空白組； LPS(10、20、30 μg/mL)分別培養12和24 h；采用噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法檢測細胞增殖情況,在酶標儀上測定 490 nm 處的吸收度值 A。

2.6.2 PCP-1、PCP-2對LPS誘導的GMC細胞增殖的影響

取對數生長期細胞，以1.0×104個/mL的濃度，分別接種于96孔板，培養12 h后棄去培養基，各孔加入無血清培養基同步培養24 h。培養基棄去，將細胞分為空白組、模型組、PCP-1組、PCP-2組。10 μg/mL LPS、10 μg/mL LPS+PCP-1(10、50、100 μg/mL)組、10 μg/mL LPS+PCP-2(10、50、100 μg/mL)組 (均以無血清的RAMI-1640配制)。培養24 h后進行MTT法測定。

2.6.3 活性多糖對GMC增殖相關因子的影響

ELISA 法測定各組細胞上清液中 LN、 FN蛋白,將GMC細胞傳代于5瓶25T透氣培養瓶后用含10%血清培養液5 mL培養24 h，棄去培養液用不含血清培養基培養24 h。將培養瓶分為5組，分別為空白組，模型組，PCP-1給藥組。將5瓶中分別加入培養基，10 μg/mL LPS，LPS+PCP-1(10、50、100 μg/mL)，培養24 h后，細胞備用。細胞培養液按試劑盒要求的步驟進行操作,測定各組細胞上清液中 LN、 FN的含量。

3 結果

3.1 PCP經SePhadex G-50凝膠柱洗脫結果

耙齒菌經水提醇沉，除蛋白后得到粗多糖(PC)，收率為30.24%。PC經離子交換樹脂純化后得PCP，顏色由原來的淺褐色變成灰白色，除去了大量的雜質，總糖含量明顯提高，蛋白質含量明顯降低，收率可到達70.36%。PCP經SePhadex G-50凝膠柱洗脫，繪制洗脫圖，見圖1。如圖1可知，PCP經過凝膠色譜的分離，得到兩個部分，分別收集，命名為PCP-1和PCP-2。

圖1 PCP經SePhadex G-50洗脫圖Fig.1 PCP eluted by SePhadex G-50 注：Ve為內水體積，VO為外水體積。Note:Ve is the volume of internal water,VOis the volume of external water.

3.2 PCP-1、PCP-2理化性質的測定

理化性質結果見表1。結果顯示，PCP經過凝膠柱分離后，得到的PCP-1、PCP-2總糖含量分別為98.05%、96.92%，酸性糖、蛋白質幾乎沒有。PCP-1含有Man、Glc和Gal，且Gal的含量最高，摩爾比例為2.3∶1.2∶3.3；而PCP-2只含有Glc。

表1 PCP-1、PCP-2中性糖、酸性糖、蛋白質含量和組成糖的測定結果Table 1 Determination of PCP-1,PCP-2 neutral sugar,acid sugar,protein content and composition sugar

3.3 PCP-1、PCP-2分子量測定

樣品按2.3中色譜條件進樣，得到色譜圖如圖2所示。根據供試品的保留時間計算樣品各組分的重均分子量，PCP-1、PCP-2分子量分別為30 000和8 000 Da。

圖2 PCP-1 、PCP-2 GPC色譜圖Fig.2 PCP-1,PCP-2 GPC chromatogram 注：左：PCP-2;右:PCP-1；Note:left:PCP-2;Right:PCP-1

3.4 PCP-1、PCP-2化學結構

3.4.1 IR分析結果

由圖3，PCP-1光譜圖可知，寬峰3 330 cm-1是O-H的伸縮振動，是多糖類化合物的特征吸收；2 930 cm-1為C-H的伸縮振動峰；1 610 cm-1為C-O的伸縮振動峰；1 408 cm-1處的吸收峰是C-H的變角振動；1 025 cm-1處的吸收峰表明PCP-1包含吡喃糖類型的結構；另外，是多糖中的C-O、C-O-C的伸縮振動和C-OH的彎曲振動特征峰；852和744 cm-1處于950～700 cm-1之間，說明具備α-和β-兩種構型。

由圖3，PCP-2光譜圖可知，在3 350和2 930 cm-1的吸收峰分別為O-H、C-H2的伸縮振動峰；1 610 cm-1為糖的水化物的吸收峰；1 408 cm-1處的吸收峰是C-h的變角振動；1 020、1 080、1 150、851 cm-1處的吸收峰是多糖中α-吡喃環伸縮振動特征峰。由此可知，PCP-2為α-構型吡喃聚糖。

圖3 PCP-1、PCP-2 FT-IR光譜圖Fig.3 PCP-1,PCP-2 FT-IR sPectrum 注：左：PCP-2;右:PCP-1；Note:left:PCP-2;Right:PCP-1

3.4.2 甲基化 GC-MS分析

通過與參考文獻對照[12]，得甲基化分析結果，列于表 2。結果顯示，PCP-1主要包含7種糖殘基，其中有1個末端，2個分支點，末端和分支點之和的數量相等且糖殘基中Man、Gal、Glc的比例也和上述組成糖的結果一致，以上分析說明甲基化的結果是合理的。PCP-2沒有分支，為直鏈結構，且為1、6連接。

表2 PCP-1和PCP-2甲基化結果Table 2 PCP-1 and PCP-2 methylation results

續表2

保留時間tR(min)糖殘基Sugar residues摩爾比例Molar ratio連接方式Attended mode22.281 2,3,4- Me3- Man1.0→6)- ManP-(1→23.9202,3,4- Me3- Gal10.0→6)- GalP-(1→26.536 2,4- Me3- Man2.5→3,6)- ManP-(1→27.8553,4-Me2- Gal5.0→2,6)- GalP-(1→PCP-216.7202,3,4,6-Me4-Glc1.0→1)- GlcP18.5382,3,4- Me3-Glc19.00→1,6)- GlcP

3.5 耙齒菌多糖抗GMC增殖活性

3.5.1 LPS誘導的GMC增殖模型

GMS細胞在接種后12小時到72小時內處于對數增長期。可用于細胞模型建立。由表3可知，LPS作用于GMC細胞，可劑量依賴性地刺激系膜細胞增殖。當采用10 μg/mL的LPS誘導24 h時細胞抑制率為50%(P<0.01)，以此作用時間建立氧化應激細胞模型。

表3 LPS誘導細胞增殖情況Table 3 LPS induced cell proliferation

注：與空白對照組比較，*P<0.05;**P<0.01。

Note:Compared with control,*P< 0.05;**P< 0.01.

3.5.2 PCP-1、PCP-2對LPS誘導的GMC增殖的影響

由圖4可知，模型組與空白組相比有顯著性差異，說明LPS造模成功。PCP-1對LPS細胞增殖具有明顯的保護作用，當劑量增大，呈現顯著性差異，呈現明顯且呈現一定的量效關系，而PCP-2無此作用。

圖4 PCP-1和PCP-2對GMC細胞活力的影響Fig.4 Effects of PCP-1 and PCP-2 on the activity of GMC 注：空白組相比，#P<0.05；##P<0.01，與模型組相比，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with blank,#P<0.05;##P< 0.01,Compared with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

3.6 PCP-1對FN、LN含量的影響

FN，LN等蛋白圍繞在GMC周圍，構成GMC生存的微環境。它不僅是細胞的支架組織,還直接影響細胞的黏附、營養、代謝、增殖、分化和遷移,許多細胞因子通過 ECM 對細胞的生長、增殖和分化起調控作用。采用ELISA法測定FN、LN的含量。如圖5所示，PCP-1能夠減少LPS誘導的GMC細胞中FN和LN蛋白的釋放，并呈現量效關系。

圖5 PCP-1對LPS誘導的GMC細胞中FN和LN含量的影響Fig.5 Effect of PCP-1 on the content of FNand LNin GMC cells induced by LPS 注：空白組相比，#P<0.05；##P<0.01，與模型組相比，*P<0.05；**P<0.01。Note:Compared with blank,#P<0.05;##P<0.01,Compared with control,* P < 0.05;** P < 0.01.

4 討論

腎小球腎炎是我國臨床上的常見的腎臟疾病，其病程長，危害大。腎小球系膜細胞(GMC)增殖和細胞外基質(ECM)增多是主要的病理改變。ECM增多是指ECM合成增多或降解減少導致的ECM蛋白組分過度積聚。ECM主要蛋白組分包括Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白 (LN)和蛋白聚糖等。GMC是腎小球三種固有細胞成分(GMC、內皮細胞、臟層上皮細胞)中功能最活躍的細胞，GMC受到外界因素刺激后，會產生各種細胞因子，這些細胞因子相互作用，最終導致腎炎的發生及發展。GMC產生ECM的作用最強，是ECM的主要產生細胞或稱效應細胞。所以，若能有效保護GMC，抑制GMC增殖，則可延緩腎小球硬化，防止腎衰的發生。耙齒菌多糖在臨床上治療腎小球腎炎有良好的應用基礎，但是，國內外對白囊耙齒菌的研究很少，耙齒菌多糖的活性成分尚不清楚。本實驗分離純化得到的耙齒菌均一多糖PCP-1能有效抑制GMC的異常增殖，減少LN，FN等相關因子的釋放，為耙齒菌多糖的活性成分。本研究為進一步研究耙齒菌均一多糖的結構和活性提供實驗基礎。為益腎康膠囊確定合理的工藝，建立有效的質量控制方法，為多糖治療慢性腎炎的構效關系這一科學問題，提供有益的借鑒和數據。