一測多評法測定無硫和低硫白芷中5種香豆素類成分的含量

張 強，宋 寶，謝冬梅， 2，王國凱

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院中藥資源保護與開發研究所，安徽 合肥 230012)

白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.或杭白芷A.dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[1]，具有祛風散寒、通竅止痛、消腫排膿、生肌起痿、燥濕止帶之功效[2-3]。香豆素類成分是白芷中主要成分[4-5]。

一測多評法是利用中藥有效成分內在函數關系和比例關系，只測定一個成分從而實現多個成分的同步測定，是一種較為簡單易行的中藥多指標評價的新方法與多指標質量評價的新模式[6]。楊芳等[7]建立一測多評法測定川白芷藥材中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量，可準確控制川白芷的質量。

商品白芷經過硫磺熏蒸，其有效成分含量會明顯降低[8]。如何建立一種簡便、易行、快捷的方法比較無硫和低硫白芷的質量差異，是目前整體評價無硫和低硫白芷質量的難題。本研究建立了一測多評方法比較無硫和低硫白芷中歐前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯及水合氧化前胡素等5種香豆素類成分的含量，以期為評價白芷藥材質量提供依據。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 甲醇(色譜純)：德國Merck公司；水為超純水；水合氧化前胡素、佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素對照品(批號分別為CFS201801、CFS201801、CFS201802、CFS201802，純度均為98%)：武漢天植生物技術有限公司；異歐前胡素(批號110827-201812)：中國食品藥品檢定研究院。白芷藥材2017年收集于安徽亳州、四川遂寧、河南禹州等地(見表1)，由安徽中醫藥大學生藥系謝冬梅副教授鑒定為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.的干燥根。

表1 白芷樣品表

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1100、Shimadzu LC-16型及Thermo U3000型)；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AX324ZH型電子天平：奧豪斯儀器有限公司；AB135-S電子天平：瑞士梅特勒托利多公司；JK-450B型超聲儀：合肥金克尼機械制造有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取水合氧化前胡素、佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素對照品，加甲醇溶解，定容，制得水合氧化前胡素0.495 mg/mL、佛手柑內酯0.195 mg/mL、氧化前胡素0.995 mg/mL、歐前胡素2.000 mg/mL及異歐前胡素0.995 mg/mL混合對照品溶液。過0.22 μm微孔濾膜，待用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取白芷藥材粉末(過3號篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL離心管中，加甲醇25 mL，稱質量，超聲(功率為300 W，頻率為50 kHz)提取1 h后，冷卻至室溫，甲醇補足質量，離心(溫度為4 ℃，轉速為3 000 r/min，離心時間為5 min)，靜置，吸取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，水(A)-甲醇 (B)流動相，梯度洗脫(見表2)；流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長300 nm，進樣量10 μL。見圖1。

表2 梯度洗脫程序

圖1對照品(A)與白芷樣品(B)的高效液相色譜圖(1.水合氧化前胡素；2.佛手柑內酯；3.氧化前胡素；4.歐前胡素；5.異歐前胡素)

2.1.4 線性關系考察 將“2.1.1”項下對照品溶液分別精密吸取0.2、0.4、0.8、2.0、4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，按“2.1.3”項下的色譜條件測定，記錄。以白芷的5個對照品溶液濃度(ρ)為橫坐標，以對應對照品的峰面積(A)為縱坐標，建立標準曲線。見表3。

表3 香豆素成分的線性關系

2.1.5 精密度試驗 取混合對照品溶液，重復進樣6次，測定，記錄峰面積， RSD值分別為0.26%，0.47%，0.12%，0.07%，0.16%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 選取1號樣品，按“2.1.2”項方法制得供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定，記錄峰面積。結果RSD值分別為2.04%、1.67%、1.73%、1.73%、1.56%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 選取1號樣品，平行6份，精密稱定，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，測定并記錄峰面積計算其含量，結果RSD值分別為1.25%、0.89%、1.32%、0.96%、1.12%。結果表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取14號樣品6份，分別加入一定量對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。測定并記錄峰面積，計算回收率，見表4。結果表明水合氧化前胡素、佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素平均回收率分別為96.74%、99.69%、100.26%、99.48%、101.74%，RSD值分別為0.82%、0.97%、0.77%、0.65%、0.33%。說明該方法的加樣回收率良好。

2.2 相對校正因子的確定

2.2.1 相對校正因子的計算 根據在色譜定量分析的基本理論，高效液相響應值的大小與各物質的質量呈線性關系，即m=f·A。相對校正因子fi/s=fi/fs=(Ai×ms)/(mi×As)，其中As為內標物峰面積，ms為內標物的質量，Ai為待測成分i的峰面積，mi為待測成分i的質量。取“2.1.1”項下對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件，改變進樣量為2、4、8、10、20 μL，記錄峰面積，計算各校正因子。見表5。

表4 加樣回收率試驗結果(n=6)

表5 以歐前胡素為內標、其余4個香豆素類

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)；f2為f(歐前胡素/佛手柑內酯)；f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)；f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)；各校正因子均為平行測定3次結果的均值

2.2.2 儀器和色譜柱的考察 取“2.1.1”項下對照品溶液，在“2.1.3”項下的色譜條件，平行進樣3次，得各峰面積平均值，計算各相對校正因子，由表6可知RSD均小于3.0%，結果表明不同高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子無顯著影響。見表6。

2.2.3 不同柱溫、流速對校正因子的影響 同一色譜條件下，考察25、30、35 ℃柱溫、考察0.9、1.0、1.1 mL/min流速對校正因子的影響。由表7可知，柱溫及流速的變化對相對校正因子無顯著影響。

表6 不同儀器和不同色譜柱測定的相對校正因子值(n=3)

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)，f2為f(歐前胡素/佛手柑內酯)，f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)，f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)

2.2.4 待測成分色譜峰的定位 在確定各待測成分的位置時，選取保留時間差值和相對保留時間值兩種方法定位。為了增加定位各組分的可信度，采用了不同的高效液相色譜儀和不同色譜柱進行定位考察。由表8可知t(歐前胡素/水合氧化前胡素)、t(歐前胡素/佛手柑內酯)、t(歐前胡素/氧化前胡素)、t(歐前胡素/異歐前胡素)、Δt(歐前胡素/水合氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/佛手柑內酯)、Δt(歐前胡素/氧化前胡素)、Δt(歐前胡素/異歐前胡素)的RSD分別為1.94%、2.15%、0.86%、1.76%、19.43%、32.49%、50.88%、39.27%。結果表明相對保留時間的重復性較好。

2.3 一測多評法與外標法的比較 精密稱取20批藥材粉末0.5 g，按“2.1.2”項方法制成供試品溶液，進樣，記錄峰面積，采用外標法和一測多評法分別計算各成分的含量。由表9可知兩種方法所測得5種香豆素成分含量結果基本一致，表明一測多評法在無硫和低硫白芷多成分測定是可行的。

表7 不同流速對白芷4種校正因子的影響(n=3)

注：f1為f(歐前胡素/水合氧化前胡素)，f2為f(歐前胡素/佛手柑內酯)，f3為f(歐前胡素/氧化前胡素)，f4為f(歐前胡素/異歐前胡素)

表8 相對保留值及保留時間差值的比較(n=3)

注：t1為t(歐前胡素/水合氧化前胡素)，t2為t(歐前胡素/佛手柑內酯)，t3為t(歐前胡素/氧化前胡素)，t4為t(歐前胡素/異歐前胡素)；相對保留時間為歐前胡素與水合氧化前胡素、氧化前胡素、異歐前胡素的保留時間之比，保留時間差的絕對值為各物質與歐前胡素保留時間差值的絕對值

表9 外標法和一測多評法測定無硫和低硫白芷中5種成分的含量

3 討論

前期研究基礎結合相關文獻[9-11]，確定色譜條件為甲醇-水系統，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，波長為300 nm，流速為1.0 mL/min。該方法分離度良好，可以對白芷多成分進行定量分析。

本研究通過一測多評對水合氧化前胡素、佛手柑內酯、氧化前胡素、歐前胡素及異歐前胡素5種白芷中香豆素類成分含量進行了測定。通過不同儀器、色譜柱、進樣量、流速及柱溫可知相對校正因子的RSD值均小于3.0%，說明各因素對相對校正因子無顯著性影響，確立的4種校正因子適用于白芷的一測多評法含量測定。與無硫相比，低硫白芷各成分含量均有下降，且佛手柑內酯與氧化前胡素最為明顯。僅有部分低硫白芷歐前胡素含量符合2015年版《中華人民共和國藥典》規定，說明僅以歐前胡素含量為限量指標不足以全面控制白芷質量。

研究結果表明外標法和一測多評法測定白芷中5種香豆素成分的含量無顯著性差異，說明該方法不僅可用于白芷中5種香豆素類成分同時測定，還可以用來控制硫熏白芷的臨床安全性。采用一測多評法不僅對現有質量控制方法有提升，而且還更快捷、可靠。