重樓總皂苷對人胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲能力的影響

洪星輝，王 靚，方海雁，黃金玲

(1.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學護理學院，安徽 合肥 230012)

胃癌是一種侵襲性較強的消化道惡性腫瘤,其發病率和死亡率均居于惡性腫瘤的前列[1]。據報道，中國每年新增病例大約占全球的40%[2]。盡管近年來對早期胃癌的診斷技術不斷進步，外科微創技術和化學治療等多種治療手段也已廣泛運用于胃癌的治療,但是進展期胃癌的預后差和5年存活率低的問題仍然沒有得到有效的解決。因此，如何有效抑制進展期胃癌的浸潤和轉移不僅是目前科研探索的方向，更是提高臨床療效和改善患者術后生存率的關鍵性問題。

重樓總皂苷(Rhizoma Paridis total saponin，RPTS)是從中藥重樓中提取出來的一種皂苷類成分。《神農本草經》中記載重樓具有清熱解毒、消腫止痛的功效。現代藥理學研究表明RPTS具有較好的抗腫瘤活性，對胃癌、結直腸癌、肺癌等多種腫瘤細胞增殖均有明顯的抑制作用[3-6]。但是RPTS抗腫瘤侵襲轉移方面的作用及其機制還少有文獻報道。本實驗旨在觀察RPTS對人胃癌細胞SGC-7901增殖、遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與儀器

1.1 細胞 人胃癌細胞SGC-7901購自中科院上海細胞研究所細胞庫。

1.2 藥物與試劑 重樓為中藥飲片，采購自安徽濟仁藥業有限公司，產地為云南，批號111012，經安徽中醫藥大學中藥與資源教研室俞年軍教授鑒定，確認為云南重樓ParispolyphyllaSmithvar.yannanensis(Franch)Hand.-Mazz。按照參考文獻[7-10]方法提取制備得干浸膏。高氯酸比色法[11]測定重樓醇提物中PRTS質量分數為62.6%。四甲基偶氮唑藍( methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；DMEM高糖細胞培養基、胎牛血清購自美國HyClone公司；Transwell小室(直徑8 μm)購自美國Millipore公司。

1.3 主要儀器 Forma 370細胞培養箱：美國Thermo公司；Centrifuge 5430R超低速離心機：德國Eppendorf公司；SPEC-TRAMax M2e酶標儀：美國Molecular Devices公司；BX51倒置顯微鏡：日本Olympus公司。

2 方法

2.1 細胞培養 SGC-7901細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液中,37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養,取對數生長期細胞進行各項實驗。

2.2 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的SGC-7901細胞，胰酶常規消化，用DMEM高糖完全培養液調整細胞濃度至5.0×104/mL，將細胞懸液以每孔200 μL接種于96孔培養板中，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養24 h后，于各孔中加入終濃度分別為0、2.5、5、10、20、40 μg/mL RPTS，每組6個復孔，繼續培養24 h，到達時間作用點后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL、37 ℃孵育4 h，棄上清后加入150 μL DMSO,平板搖床震搖10 min，用酶標儀測量各孔在490 nm波長處的吸光度(absorbance, A)，用光密度(optical density, OD)值表示A的大小。實驗重復3次，計算細胞活力(cell viability ratio,RCV)。RCV的計算公式：

RCV=(A實驗―A空白)/(A對照―A空白) 100%。

2.3 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率 取對數生長期的SGC-7901，計數，調整細胞濃度至7×105/mL，接種于6孔板當中。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中，待細胞貼壁，用10 μL槍頭在孔板底部中央均勻劃出一條橫線，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)清洗后，在各孔中分別加入終濃度為0、2.5、5、10 μg/mL的RPTS，用無血清高糖DMEM培養，0、24 h光學顯微鏡下拍照(10×20倍)，觀察細胞遷移情況。通過軟件計算細胞劃痕寬度，實驗重復3次并計算細胞24 h 遷移率(migration ratio,Rm)。Rm的計算公式：

Rm=(l0 h-l24 h)/l0 h。

式中l0 h、l24 h分別表示0、24 h劃痕寬度。

2.4 Matrigel transwell實驗檢測細胞侵襲能力 將BD膠和預冷的無血清DMEM培養液按1∶3比例稀釋混勻，取100 μL均勻地鋪在帶有8 μm孔徑聚碳酸酯膜的Transwell小室內，并放置在37 ℃恒溫培養箱中靜置1 h，使BD膠凝固。將Matrigel transwell小室至于24孔板中，同時下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養液。調整細胞濃度至1.0×106/mL，Transwell上室內加入細胞懸液100 μL。在恒溫細胞培養箱中孵育6 h待其貼壁后，加入不同濃度RPTS(0、2.5、5、10 μg/mL)繼續培養24 h,每組設置3個復孔。取出Matrigel transwell小室，用棉簽小心擦去小室上層未遷移細胞，并用PBS清洗3次后，用0.1%結晶紫在室溫染色20 min。用PBS清洗3次。每組隨機選取5個不同高倍視野(10×20倍)計細胞數。實驗重復3次。

3 結果

3.1 RPTS對人胃癌細胞SGC-7901增殖的影響 實驗結果表明RPTS(10、20、40 μg/mL)處理SGC-7901細胞24 h之后，有明顯抑制作用(P<0.05)，隨著濃度的升高，細胞的增殖率逐漸減少。但RPTS(2.5、5 μg/mL)組與空白對照組相比，OD值差異并無統計學意義，說明RPTS(2.5、5 μg/mL)對細胞增殖沒有明顯抑制作用，結果見圖1。因此為盡量減少RPTS對細胞毒性作用的影響，篩選RPTS(2.5、5、10 μg/mL)作為后續藥效學實驗研究。

3.2 RPTS對人胃癌細胞SGC-7901遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，2.5、5、10 μg/mL濃度RPTS給藥組處理細胞24 h后，劃痕距離明顯大于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而且RPTS的遷移抑制作用呈濃度依賴關系，結果見圖2、圖3。

3.3 RPTS對人胃癌細胞SGC-7901侵襲能力的影響 Matrigel transwell小室下室細胞經結晶紫染色，在Olympus BX51倒置熒光下觀察，可以看出2.5～10 μg/mL濃度RPTS給藥組，下室侵襲細胞數量明顯減少，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。且隨著RTPS濃度的增加，侵襲細胞數逐漸減少，表現出劑量依賴關系。結果見圖4、圖5。

注：與0 μg/mL RPTS組比較，*P<0.05

注：與0 μg/mL RPTS組比較，*P<0.05

4 討論

腫瘤可以侵襲和轉移到相距很遠的組織和器官當中。對于還沒有形成遠距離轉移的腫瘤而言，其治愈率可以達到90%[12]。然而當腫瘤細胞轉移至其他組織，現代醫療水平很難達到理想的治療效果。

在臨床上，腫瘤細胞發生侵襲和轉移是多步驟、多階段的綜合過程，一般要經過腫瘤管道的生成、形態改變、運動能力的增加、分泌蛋白酶、降解基底膜、在管道中運輸、繼發器官的生長等步驟[13]。而胃癌細胞的轉移更是涉及血管、淋巴轉移、腹腔的種植性轉移，以及肝臟的轉移，這些不可預期的轉移途徑是導致患者術后復發和大多數胃癌患者死亡的主要原因。現代腫瘤學和分子生物學研究表明，胃癌細胞黏膜下層的浸潤深度以及轉移的過程十分復雜,不僅與腫瘤的病理分型和組織分化程度緊密相關，而且還涉及到多條信號轉導通路和多層次的交叉調控。

注：A. RPTS 0 μg/mL組；B. RPTS 2.5 μg/mL組；C. RPTS 5 μg/mL組；D. RPTS 10 μg/mL組

圖4倒置熒光顯微鏡下觀察RPTS對人胃癌細胞SGC-7901體外侵襲能力的影響(10×20倍)

本實驗在前期研究RPTS抗人胃癌細胞增殖活性基礎上，進一步探索了RPTS對人胃癌細胞遷移和侵襲的能力。本研究發現，RPTS 10、20、40 g/mL劑量組具有較好的體外抗人胃癌細胞SGC-7901增殖的活性。為盡量減少RPTS對細胞毒性作用的影響，筆者篩選RPTS 2.5、5、10 μg/mL劑量組進行劃痕和Transwell實驗研究，結果發現RPTS表現出較好的抑制SGC-7901細胞遷移和侵襲的作用，且呈現出劑量依賴關系。

注：與空白對照組比較，*P<0.05

綜上所述，RPTS可抑制人胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的過程，其分子學機制有待進一步研究。