孕晚期大鼠暴露于七氟醚對其子代神經發育潛在毒性的脂質組學和轉錄組學研究

金 憶 胡小雪2 楊澤勇

(1上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院麻醉科-上海市胚胎源性疾病重點實驗室 上海 200030;2上海中醫藥大學附屬光華中西醫結合醫院麻醉科 上海 200052)

孕婦反復或長期暴露于麻醉藥物可能對發育中的嬰兒產生神經毒性,但其機制仍不清楚[1]。七氟醚是臨床上常用的吸入性麻醉劑,使用方便、麻醉效果佳、呼吸道刺激小,是目前臨床應用最為廣泛的吸入麻醉藥物。七氟醚可能會對大腦發育產生影響,從而引起行為障礙,該過程的病理機制可能涉及氧化應激、神經細胞凋亡、神經炎癥、突觸性質改變等。我國每年有超過1 000萬孕婦接受麻醉,懷孕期間重復或長期麻醉藥物暴露會導致發育神經的損害和子代的認知功能紊亂。長時間吸入麻醉對腦部神經突觸有損傷作用[2],特別是對未成熟的神經元會導致明顯的神經損害[3-4]。長時間接觸高濃度七氟醚會改變新生大腦中的葡萄糖和氨基酸代謝過程及細胞內的抗氧化劑與滲透物質系統[5],降低脂質中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油,并增加4-羥基非烯醇[6],而磷脂酰絲氨酸參與神經元存活、神經突起生長和突觸形成有關的信號通路[7-10]。已知脂質的異常變化可能會打破磷脂的平衡,大部分吸入麻醉藥都是脂溶性的,易透過胎盤屏障。探討藥物誘導損傷模型中新的生物標志物,特別是從腦和血清樣本中識別出新的生物標志物,可能有助于早期發現麻醉藥物暴露的潛在神經毒性。目前對于吸入七氟醚后子代神經發育的影響存在爭議,孕期大鼠持續吸入七氟醚后,有些子代神經細胞發生了凋亡和行為學的改變[11],但也有一些實驗為陰性結果。因此,母代孕晚期接觸七氟醚是否會引起子代神經發育的障礙需要進一步的科學探索。本研究首次通過脂質組學和轉錄組學探討七氟醚對子代發育神經的潛在毒性機制。利用超高效液相色譜質譜(ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry,UPLC/MS)技術從脂質組學方面來明確哪一種脂質代謝參與神經潛在損傷的發生,通過RNA-Seq進一步篩選差異表達基因,并使用RT-qPCR在損傷模型上進一步驗證損傷過程中對應基因的變化。

材料和方法

麻醉和試劑動物研究(包括大鼠安樂死程序)按照上海交通大學實驗動物中心標準管理規程執行(編號:SMP-ADM-000-A),我校實驗動物中心的許可證號(編號:A 2016077),遵循國際實驗動物評估及認可委員會(AAALAC)和動物保護和使用機構委員會(IACUC)的規定進行動物護理。

孕15～17天的SD大鼠(體質量400～500 g)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,無病毒、細菌和寄生蟲病原體。將孕大鼠單獨放入標準箱房中飼養,喂食顆粒飼料(江蘇醫藥生物工程有限公司)和高溫殺菌純凈水。飼養條件:溫度(23±2)℃,相對濕度50%±15%,12 h光暗輪替,空氣壓力100 kPa,15次/h空氣完全過濾一次。試劑:HPLC級乙腈和甲酸(美國Merck公司),TOF-MS校準液(美國AB SCIEX公司),超純水來源于Milli-Q純凈水系統(美國米利波公司)。

實驗分組將28只孕大鼠隨機分為實驗組(S組)和對照組(C組),每組14只。飼養1～3天后,S組孕大鼠在麻醉箱內接受2%七氟醚+98%氧氣6 h;C組孕大鼠在麻醉箱內以相同的流速吸入100%氧氣6 h,總氣體流量為400 mL/min,用氣體分析儀(德國Drager公司)測定氧、二氧化碳和七氟醚的濃度。七氟醚麻醉終止后,每組隨機取8只孕大鼠,腹主動脈血樣采集40 μL,用I-STAT 1分析儀(MN:300-G,美國Abbott Park公司)分析血氣。其余孕大鼠回飼養箱內等待分娩,S組子代43只,C組子代48只,每組隨機抽出12只出生后7天的子代大鼠,七氟醚麻醉,2組新生大鼠斷頭后采集血清標本,即刻在冰面上取出海馬和皮層組織。血清標本、海馬及皮層組織于-80 ℃冷凍保存備用。

樣品制備和UPLC/TOF-MS12 000*g離心(4 ℃) 10 min獲得子代血清樣本,取10 μL轉移到無菌的EP管中,加入10 μL優質等級純水及5 μL異丙醇(10 μg/mL),用40 μL冷異丙醇+1 %甲酸(v/v)進行旋渦混合,沉淀蛋白質。-20 ℃靜置20 min,13 000*g離心10 min,取10 μL上清液轉移到玻璃式HPLC小瓶(96孔板)中進行衍生化,采用HPLC-MS聯用技術進行分析。用電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)在正離子模式下進行LC-MS檢測,用多重反應監測(multiple reaction monitoring,MRM)對每種化合物進行定量分析。色譜分析采用ACQUITY超高效液相色譜系統(美國Waters公司)分析,水同步高清晰度飛行時間質譜(TOF-MS)系統(美國Waters公司)陰極ESI源在UPLC上以正負模式顯示,IDA模型用于正負離子模式,由TOF-測量掃描(m/z=100)和緊隨6次TOF-MS/MS掃描(m/z=100～1 500)組成,累積時間分別為0.08 s和0.1 s,以確保測量質量的精確性。

PLS-DA分析在代謝組學分析之前,使用Marker View軟件(美國AB SCIEX公司)對原始數據進行預處理,并將其歸一化為總面積,以糾正每個樣本的濃度偏差。采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)方法進行檢測,比較樣本間差異,確定關鍵化合物,并對數據進行處理。獲取包含樣本變量的數據矩陣,以分析下一個代謝物。在PLS-DA模型中可變影響的化合物預測值(Vip)>1.0和P<0.05獲得潛在生物標記物[12]。

HE染色對6只新生大鼠的海馬和大腦皮質神經元進行HE染色,檢測細胞凋亡。切片去蠟,水合,HE染色。切片脫水、包埋,400倍顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下計數CA1錐體細胞數目并拍照,僅包括細胞核和核仁明顯的細胞。

TUNEL染色將6只新生大鼠海馬和皮層組織制成冰凍切片,浸泡在含3% H2O2的PBS中,消除內源性過氧化物酶反應。PBS(pH=7.4)洗滌3次、每次5 min,加入20 % FBS和3 %FBS蛋白15 min。加入與熒光素連接的TUNEL反應液,切片置于37 ℃加濕箱中1 h,PBS洗滌3次,每次5 min。切片在室溫下與終止液反應10 min,在37 ℃下與抗地高辛過氧化物酶抗體反應30 min,PBS洗滌3次,每次5 min。再用DAB(3,3’-二氨基聯苯胺)顯影,二甲苯透明后用中性樹脂密封。切片置于熒光顯微鏡下拍照,并觀察TUNEL陽性染色結果。

RNA提取將6只新生大鼠的皮層組織塊與少量液氮混合后迅速研磨,重復3次。將皮層組織細胞培養皿置于冰上,加入Trizol裂解5～10 min。4 ℃下12 000*g離心15 min,吸取上層水相,移至另一離心管中,按Trizol∶異戊醇=1∶0.6 (v/v)混勻,室溫放置5～10 min。4 ℃下12 000*g離心10 min,棄上清,按Trizol∶75 %乙醇=1∶1(v/v)溫和振蕩,懸浮沉淀。室溫晾干或真空干燥5～10 min,檢測260 nm下吸光度(D)值,定量RNA濃度。

RNA-seq實驗流程提取的總 RNA 樣品經瓊脂糖電泳和 Nanodrop 質檢及定量后,用 oligo(dT)磁珠富集 mRNA,若 RNA 為降解樣品或為原核樣品則直接用 rRNA 去除試劑盒進行處理;RNA 測序文庫均由試劑盒完成,包括 RNA 片段化后用隨機引物反轉生成第一鏈 cDNA,加入 dUTP 合成第二鏈 cDNA,雙鏈 cDNA 末端修復加 A 后連接 Illumina 匹配接頭,PCR 擴增得到最終文庫;構建好的文庫用 Agilent 2100進行質檢,并由 qPCR 方法進行文庫定量,使用 Illumina Hiseq 4000 測序儀進行測序。

結 果

動脈血氣分析為消除低氧血癥或二氧化碳蓄積等因素干擾,對實驗動物進行動脈血氣分析(表1),血氣分析結果與氧和二氧化碳交換相關的各項數據都在正常安全范圍之內,兩組間pH值和動脈血二氧化碳的差異無統計學意義。S組大鼠僅受七氟醚的影響而不受七氟醚麻醉所致動脈血氣的影響,因此動物模型建成。

UPLC/TOF-MS分析七氟醚誘導的神經毒性UPLC/TOF-MS分析分別采用正電離和負電離兩種模式,獲得代謝組學圖譜(圖1)。分別對每組6個QC樣品進行測定,在負離子和正離子模式下產生10個生物標記的保留時間和6個共峰的峰面積配對保留時間m/z(表2)。保留時間的RSD<3.71%,峰面積的RSD為3.62%～38.58%。

表1 兩組孕大鼠實驗后動脈血氣分析比較Tab 1 Arterial blood gas analysis between two groups

C group:Control group;S group:Sevoflurane prenatal exposure group.pH:Potential of hydrogen;PaCO2:Partial pressure of carbon dioxide in arterial blood;HCO3:Carbonic acid hydrogen radical;BE:Residual value of blood alkali;SaO2:Degree of blood oxygen saturation.

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)兩組采用UPLC/TOF-MS樣品剖面進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和PLS-DA檢測。在正離子模式下獲得更好的分離效果(圖2)。采用3個參數對P的性能進行評價。LS-DA模型在正離子模式下:R2X=0.665,R2Y=0.996,Q2=0.962,因此選擇PLS-DA模型。

表2 孕晚期暴露于七氟醚誘導神經毒性的新生大鼠脂質中的標記物、通路和疾病Tab 2 Sevoflurane induces neurotoxicity potential markers and associated pathways or diseases in lipids of newborn rats in late pregnancy

RT:Retention time (min);m/z:Mass-to-charge ratio.The independentttest was verified by Graph Prism 5.0 in serum of group S and group C.P<0.05.↑:Up regulation.↓:Down regulation.

A:ESI positive mode;B:ESI negative mode.The UPLC/TOF-MS analysis was performed using an Acquity TMUPLC system coupled to a SynaptTMG2 high-definition time-of-flight mass spectrometry system with ESI positive and negative modes.In both positive and negative ion modes,basic peak chromatogram profiles displayed no difference between S and C groups.ESI:Electrospray ionization.

圖1 基于UPLC/TOF-MS分析新生大鼠血清陽性和陰性ESI的典型基峰強度色譜圖
Fig 1 Typical base peak intensity chromatogram of the rat serum obtained in ESI positive andnegative mode based on UPLC/TOF-MS analysis

七氟醚治療脂質代謝途徑分析用Metabo Analyst(http://www.metaboanalyst.ca) 進一步分析鑒定出的生物標志物(圖3)。發現6條代謝途徑:甘油磷脂代謝、糖基磷脂酰肌醇(glycosylphos phatidylinositol,GPI)-錨定生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝,鞘脂代謝和花生四烯酸代謝,其中甘油磷脂代謝是最重要的代謝途徑。

HE染色和TUNEL染色TUNEL染色分析各子代大鼠海馬和大腦皮質神經元凋亡(圖4A、4B)。S組染色質致密、深染,形成致密團塊,HE染色的組織學切片中可能出現斷裂。細胞體積縮小,胞漿致密,嗜酸性。HE染色和TUNEL染色結果顯示兩組細胞凋亡差異無統計學意義。

C:PLS-DA in negative ion mode.S:PLS-DA in positive ion mode.

圖2 新生大鼠血清PLS-DA分析圖
Fig 2 The serum of neonatal rats analyzed by PLS-DA

RNA-seq技術利用RNA-seq技術對S組和C組試驗前后轉錄本中的差異表達基因進行全面分析(圖5),Vcan基因確實有表達上調的趨勢,兩組差異有統計學意義,并發現相關差異表達顯著基因的通路(圖6):紅色為上調,綠色為下調,RT-qPCR驗證Vcan基因表達上調明顯。

Pathway analysis on biomarkers of sevoflurane-induced neurogenerative disease model.All matched pathways were acquired according toPvalues from pathway enrichment analysis and pathway impact values from pathway topology analysis,using pathway library of Rattus norvegicus (rat).A:Glycerophospholipid metabolism;B:Glycosylphos phatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis Linoleic acid metabolism;C:Alpha-linolenic acid metabolism;D:Sphingolipid metabolism;E:Arachidonic acid metabolism.

圖3 七氟醚誘導神經退行性病變疾病模型生物標志物的通路分析
Fig 3 The pathway analysis of biological markers of theneurodegeneration disease model induced by sevoflurane

The experiment was repeated 3 times.Apoptosis in hippocampus and cerebral cortex was detected by TUNEL and HE staining.Blank:Blank group;Control:Control group;Hippocampus:Hippocampus group;Cortex:Cortex group.A and B:The black arrows indicate apoptotic cells.Observation of HE and TUNEL staining for the hippocampus and cerebral cortex tissue in morphological changes in each group (scale bar=20 μm).C and D:The statistical analysis of neural cell apoptosis was detected by TUNEL and HE staining from hippocampi and cerebral cortex tissue of each offspring rat.

圖4 各組海馬和大腦皮層組織HE染色和TUNEL染色的形態變化(*400)
Fig 4 HE and TUNEL staining for the hippocampus and cerebral cortex tissue in morphological changes of each group (*400)

A:The change ofVcangene by RT-PCR;B:The melting point curve for drawing;C:The expansion regionVcangene.D:As the standard curve.

圖5Vcan基因RT-PCR變化及熔融和擴增曲線
Fig 5Vcangene PCR RT-PCR changes,melting and amplification curves

討 論

本研究基于脂質組學,在七氟醚誘導子代潛在神經損傷的過程中,發現6種代謝途徑,包括甘油磷脂代謝途徑、GPI-錨定生物合成、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、鞘脂代謝和花生四烯酸代謝,其中甘油磷脂代謝是最重要的代謝途徑。脂質代謝的改變被認為是導致中樞神經系統損傷的關鍵因素[13],血脂異常與阿爾茨海默癥、帕金森癥和亨廷頓癥等疾病有關。吸入麻醉藥異氟醚低濃度時表現為神經保護,高濃度時誘導細胞凋亡[14]。母體妊娠過程中暴露于七氟醚可能會對其后代的神經發育產生風險[3]。本研究中,MetaboAnalyst系統用于進一步分析已鑒定的生物標志物,在S組中發現潛在的內源性代謝產物甘油磷脂和鞘磷脂。將以上3種方法與穩定同位素標記相結合,可用于分析脂類代謝(脂肪酸、甘油磷脂和鞘脂代謝)[15]。

甘油磷脂是參與哺乳動物細胞膜中的主要脂類。在許多神經退行性疾病中磷脂酰膽堿穩態被破壞[16],當溶血磷脂酰膽堿水平升高,可導致神經鞘脫髓鞘及不同程度的軸突變性[17]。細胞內磷脂酰膽堿含量減少,可能有助于預防或治療阿爾茨海默癥[18],在內質網中磷脂穩態破壞后,磷脂失衡可導致許多神經疾病。

鞘脂代謝改變最終導致神經損傷。抑制PKC的溶血磷脂會產生神經毒性,而且這些脂類會導致細胞膜結構的變化,特別是細胞膜上脂肪通道的功能改變[19]。膜脂(如神經節苷脂和鞘脂)與可溶性Aβ和不溶性形式相互作用[20-22],并影響Aβ神經毒性。鞘磷脂是由游離鞘氨醇基及其磷酸鹽、神經酰胺、鞘氨酰肌醇和復雜的鞘磷脂組成的一類不同的脂質群類,可在神經疾病等各種疾病中檢測到這類脂質群[23-25]。因此,鞘脂代謝與神經系統疾病密切相關,可能與神經疾病的發病機制有關。本研究中,脂質組學的發現進一步證實產前接觸七氟醚對子代的潛在神經毒性。

A and B:The KEGG pathway analyzed the top 10 item bar diagrams.InP-value order from low to high,the ordinate representsP-value(-log10 transformation);C:Pathway analysis of the first 5 Pathway of up and down significantly differentially expressed genes KEGG Pathway.Pathway analysis is a functional analysis mapping genes to KEGG pathways.TheP-value (EASE-score,Fisher-Pvalue or Hypergeometric-Pvalue) denotes the significance of the pathway correlated to the conditions.Lower theP-value,more significant is the pathway.The recommendP-value cut-off is 0.05.Upregulated differential expression gene KEGG pathway analysis results folder;Down-regulated differential expression gene KEGG pathway analysis results folder.DE:Differentially expressed.

圖6 調節基因的信號通路和差異表達顯著基因的通路
Fig 6 Signal pathway of differentially expressed genes and pathway results of differentially expressed significant genes

在轉錄組學方面,本研究首次揭示七氟醚子代神經毒性的轉錄表達規律,發現相關差異表達顯著基因的通路,進一步RT-qPCR驗證發現,發現孕大鼠暴露于七氟醚后,新生大鼠皮層Vcan基因表達明顯上調,Vcan基因與一種名為versican的蛋白質有關。根據KEGG 數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中的生物學通路分類條目和基因表達情況,過表達對理解Vcan如何調控包括神經發育、功能和修復在內的大腦皮層潛在毒性具有重要意義[26]。

基于UPLC/TOF-MS的脂肪組學和RNA-seq測序為探討脂質失衡導致發育神經發生相關潛在毒性提供了全面的信息。本研究中,RNA-seq技術應用于孕晚期大鼠暴露于七氟醚對其子代的潛在神經毒性,對精確調控七氟醚的濃度和時間有重要的意義。本研究提示異常的甘油磷脂和鞘脂代謝可能誘導潛在神經毒性,產前接觸七氟醚所致子代潛在發育神經毒性的病理過程還需要更多的證據,調節甘油磷脂和鞘脂代謝可作為孕晚期吸入麻醉藥長時間暴露后潛在神經損傷的治療手段。本研究為今后進一步探討孕晚期模式動物七氟醚暴露的脂質代謝組學、轉錄組學和相關潛在神經毒理學分子機制提供了理論依據。