優質牧草旋扭山綠豆對低溫脅迫的生理響應及其耐寒性快速鑒定

余涵霞, 姜朝陽, 王純, LIN Yi-han, 紀雅萍, 李偉華*

優質牧草旋扭山綠豆對低溫脅迫的生理響應及其耐寒性快速鑒定

余涵霞1, 姜朝陽1, 王純1, LIN Yi-han2, 紀雅萍1, 李偉華1*

(1. 華南師范大學生命科學學院, 廣東省華南牧草工程技術研究中心, 廣東省高等學校生態與環境科學重點實驗室, 廣州 510631; 2., Victoria 3086, Australia)

為了解旋扭山綠豆()對低溫的耐受性，以在南方各省廣泛種植的優質牧草紫花大翼豆()為對照，研究了旋扭山綠豆對低溫脅迫的生理響應。結果表明，低溫脅迫(4℃)下，旋扭山綠豆的實際光能轉化效率(Yield)和光合電子傳遞效率(ETR)在第2~8天時下降幅度顯著低于紫花大翼豆(<0.05)。低溫處理使旋扭山綠豆和紫花大翼豆超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著增加(<0.05)；過氧化氫酶(CAT)活性則顯著降低；旋扭山綠豆的過氧化物酶(POD)沒有顯著變化(>0.05)，但紫花大翼豆下降了47.11%。低溫處理下旋扭山綠豆游離脯氨酸和可溶性糖含量顯著高于紫花大翼豆(<0.05)。回歸分析、抵抗力指數和營養成分分析表明，旋扭山綠豆是一種抗寒性與營養價值均優于紫花大翼豆的優良牧草，其中Yield、ETR、CAT與滲透調節物質(游離脯氨酸和可溶性糖)可以作為旋扭山綠豆耐寒性鑒定的重要生理指標。

旋扭山綠豆；生物量；葉綠素熒光參數；過氧化物酶；游離脯氨酸；可溶性糖；低溫脅迫

我國是典型的農業大國，畜牧業是我國農業的重要組成部分，優良牧草草種選育是草食畜牧業的發展關鍵[1]，而目前飼料糧短缺已經成為我國糧食安全問題中亟需解決的重要問題[2]。旋扭山綠豆()，又名綠葉山綠豆、綠葉山螞蝗，是華南師范大學生物固氮專家莫熙穆教授1979年從澳大利亞引種的一種具有飼料、綠肥、水土保持兼用的多年生草本豆科牧草[3]。上個世紀80-90年代，旋扭山綠豆曾在廣東鑒江流域被推廣應用[3]，但之后并未在南方各省推廣開來。其中低溫可能是限制其推廣應用的重要因素之一。而低溫脅迫是牧草栽培中遇到的常見災害之一，它不僅會對植物生長造成嚴重損傷，甚至會引起植株死亡，在生產上造成嚴重損失[4]。我國南方地區水熱條件優越，適宜農作物種植。但是許多熱帶亞熱帶牧草仍然會出現冬季生長緩慢甚至停止生長的現象，從而導致冬季青飼料供應的短缺[5]。且近年來全球極端氣候頻發,南方多次出現強降雨、雪天氣，對農牧業生產造成極大損失[6]，如1999、2016年的寒害分別給廣東農業生產造成108和61億元的巨大損失[7-8]。隨著最低氣溫變化的不穩定性增加，極端寒害的影響將會進一步加重[9]。因而在優質冬青飼料草種缺乏的背景下[5]，研究引種牧草旋扭山綠豆對低溫的耐受性非常必要，有助于解決人畜爭糧的矛盾，也對更好地發展畜牧業及保護生態環境具有重要的指導意義。

很多研究表明，低溫逆境下植物可提高抗氧化酶活性并且主動積累更多的親水性滲透物質，這些物質的大量積累一方面可以清除大量有害的活性氧自由基，另一方面能夠增強細胞的保水能力，從而維持細胞滲透平衡以適應脅迫生境，與植物的抗寒性密切相關[10-13]。而葉綠素熒光參數也有助于探明光合機構受逆境脅迫傷害的部位和程度[14]。但是目前對旋扭山綠豆的研究主要在引種栽培技術[3,15]、營養器官及品質評價[16-18]、根瘤菌的抗堿性與共生固氮[19]、結瘤因子與誘導表達[20-21]、作物間作[22]、養分與微生物互作[23]和果園套種對害蟲的生態防控[24-25]等方面。最近雖有研究表明，旋扭山綠豆可在廣州冬季保持青綠越冬，具有較強的抗寒性[4]，但尚未見旋扭山綠豆對低溫脅迫生理響應的報道。

在引種和培育抗寒品種過程中，確立評價植物抗寒性的方法是其中的重要環節。目前植物抗寒性鑒定常用的方法主要有電導率法、組織褐變法和2,3,5-氯化三苯基四氮唑還原法[26]。但這些生化指標測定不僅操作繁瑣，還會損害植物，所以不適合作為植物抗寒性的快速鑒定方法進行推廣。葉綠素熒光技術由于其操作簡單，在植物抗冷性、抗凍性方面的研究逐漸增多。這一技術已在杏樹()幼苗[27]和冬小麥()[28]等植物抗寒性檢測中得到應用。同樣抗氧化酶活性和滲透調節物質含量可以在短時間內反映脅迫強度,高燦紅等[29]對玉米()的研究也證實了這一觀點。因此，本文以在南方5省(海南、廣西、廣東、福建和江西)廣泛種植的豆科牧草紫花大翼豆()[30]為對照，通過測定旋扭山綠豆在低溫脅迫下葉綠素熒光參數、抗氧化酶活性和滲透調節物質的變化，探討旋扭山綠豆抗寒的生理機制，試圖尋找旋扭山綠豆耐寒性快速鑒定的生理指標，并為今后深入開展其耐低溫的育種工作和進一步向北推廣應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料和處理

旋扭山綠豆種子來自廣東省華南牧草工程技術研究中心，紫花大翼豆種子來自海南省熱帶作物研究所。經萌發培養幼苗至15~20 cm，選取生長健壯、長勢一致的實生苗，移栽到塑料培養盆中(直徑8 cm，高10 cm)，每盆1株。基質采用營養土/沙土(體積比1∶1)的混合物。定植1周后，置于光照培養箱內(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)培養,光照周期12 h (7:00-19:00)，黑暗周期12 h (19:00-7:00)，光照強度275mol m-2s-1，培養溫度25℃,相對濕度65%。預培養72 h后取出部分植物置于另一培養箱進行低溫(4℃)處理，培養條件相同。每處理12盆重復，共計48盆。

1.2 方法

葉綠素熒光參數的測定 在培養前及處理后每隔2 d測定葉片的葉綠素熒光參數(脈沖調制熒光儀PAM-2100, Walz, Effeltrich, Germany)。選取各處理植株上層同一葉位的葉片進行測定，每處理4株。測定前葉片經過30 min的充分暗適應，測定初始熒光Fo和最大熒光Fm，光化光強度為400~ 450mol m-2s-1。最大光化學效率Fv/Fm、實際光能轉化效率(Yield)和光合電子傳遞效率(ETR)根據Gray和Schreiber的公式進行計算[31-32]。第12天(當2種植物在低溫下Yield和ETR下降至同一水平時)后停止測定，共測得0、2、4、6、8、10、12 d的葉綠素熒光參數。

抗氧酶活性的測定 在低溫處理第8天(當Yield和ETR下降幅度開始縮小時)采集植株頂端第3葉位的葉片，稱取0.1 g葉片，加入1.0 mL酶提取緩沖液，研磨成漿。在4℃下24 148.8×離心20 min,取50 mL酶液，用50 mmol L-1PBS (pH 7.8)定容至1 mL后置于冰上，用于測定抗氧化酶活性。采用氮基四唑(NBT)法測定SOD活性[33]，過氧化氫法測定CAT活性[34]，愈創木酚法測定POD活性[35]。每處理4個重復。

滲透調節物質含量的測定 低溫處理第8天采集植株頂端第3葉位的葉片，稱取葉片0.2 g，采用磺基水揚酸法[35]測定游離脯氨酸含量，采用硫代巴比妥酸法[36]測定可溶性糖含量。每處理4個重復。

生物量的測定 低溫處理結束(12 d)后，對未采集葉片的4株(4個重復)進行收獲。收獲根系時小心敲碎土壤，以減少對根系的破壞。將地上部分和地下部分分別裝入不同的信封中，置于75℃烘箱烘干，分別稱地上部分與地下部分的干質量。地上部分與地下部分的干質量之和即為總生物量。

抵抗力指數(resistance index, RS) 采用RS(t)=1-2|D|/(C+|D|)計算，其中，C表示受到低溫脅迫天后對照組的值，D表示處理組與對照組的差值[37]。

1.3 數據的統計分析

實驗數據采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。對葉綠素熒光參數(Fv/Fm、Yield 和ETR)、抗氧化酶(SOD、CAT和POD)和滲透調節物質(游離脯氨酸和可溶性糖)進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較(<0.05)；對抵抗力指數進行檢驗(< 0.05)；對低溫下的葉綠素熒光參數等8個生理指標分別與總生物量進行一元線性回歸分析，探討他們之間的相關關系。采用Origin 8.5軟件進行繪圖。

2 結果和分析

2.1 植物生物量的變化

低溫(4℃)持續脅迫12 d后與室溫(25℃)處理相比，旋扭山綠豆和紫花大翼豆的地上部分生物量、地下部分生物量和總生物量均顯著下降(圖1)，旋扭山綠豆分別降低了25%、23%和23%，而紫花大翼豆則降低了33%、39%和38%，表明2種牧草植物的耐低溫能力都有限，但顯然旋扭山綠豆受低溫的影響較小，生物量下降較小是其耐低溫的綜合體現。

圖1 旋扭山綠豆在低溫(4℃)下生物量的變化。n=4; 柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3, 4同。

2.2 葉綠素熒光參數的變化

由圖2可以看出，低溫(4℃)持續脅迫12 d后,旋扭山綠豆和紫花大翼豆的最大光化學效率(Fv/Fm)隨脅迫時間的延長而下降，且均達差異顯著性水平(<0.05)，說明低溫處理后二者的光系統Ⅱ (PSⅡ)功能受損。旋扭山綠豆的Yield和ETR在低溫處理前8 d下降的幅度均顯著低于紫花大翼豆，旋扭山綠豆的Yield在低溫處理的第2、4、6、8天分別下降了12%、9%、25%和51% [平均下降(24.25±9.56)%],而紫花大翼豆分別下降了38%、56%、57%和69% [平均下降(55.00±6.39)%]。旋扭山綠豆的ETR在低溫處理的第2、4、6、8天分別下降18%、15%、25%和49% [平均降幅(26.75±7.71)%]，而紫花大翼豆分別下降39%、54%、56%和66% [平均降幅(53.75± 5.57)%]。在低溫處理10~12 d二者的下降幅度趨于相同，說明紫花大翼豆對低溫脅迫更為敏感。

圖2 旋扭山綠豆在低溫(4℃)下葉綠素熒光參數的變化。n=4。

2.3 抗氧化酶活性的變化

從圖3可見，旋扭山綠豆的SOD活性顯著高于紫花大翼豆，但低溫處理后兩者的SOD活性增加幅度相差不大，分別增加了8.88%和8.05%。而低溫脅迫下，2種牧草的CAT活性均顯著降低，分別降低了49.71%和73.42%，紫花大翼豆的下降幅度更大。低溫處理下旋扭山綠豆的POD活性變化不明顯，但紫花大翼豆的顯著下降，下降了47.11%。

圖3 旋扭山綠豆在低溫(4℃)下的抗氧化酶活性。n=4。

2.4 滲透調節物質的變化

游離脯氨酸和可溶性糖是植物細胞內重要的滲透調節物質。從圖4可見，低溫顯著提高了2種牧草葉片中游離脯氨酸和可溶性糖含量，但旋扭山綠豆的增加幅度更大，分別提高了5.24和1.41倍, 而紫花大翼豆分別提高了3.20和0.77倍。

2.5 回歸分析

一元線性回歸分析表明，除Fv/Fm外，其他生理指標(Yield、ETR、SOD、CAT、POD、游離脯氨酸和可溶性糖)均與總生物量呈極顯著正相關(2> 0.73,<0.01或<0.001)，且Yield、ETR、SOD和游離脯氨酸與總生物量的相關性最強(>0.91,< 0.01) (表1)。

圖4 旋扭山綠豆在低溫(4℃)下滲透調節物質含量的變化。n=4。

2.6 抵抗力指數的比較

低溫處理后，旋扭山綠豆的Fv/Fm、SOD和POD的抵抗力指數均與紫花大翼豆的差異不顯著，但總生物量、Yield、ETR、CAT、Pro和可溶性糖含量的抵抗力指數均極顯著高于紫花大翼豆(表2)。

2.7 營養成分的比較

經查閱文獻，旋扭山綠豆[17]的粗蛋白(20.47%)、粗脂肪(5.89%)、無氮浸出物(43.98%)和粗灰分(9.33%)都高于紫花大翼豆(分別為17.7%、4.9%、32.3%和7.8%)[38]，而粗纖維含量(20.33%)則大幅度低于紫花大翼豆(37.3%)，且旋鈕山綠豆的所有營養指標都更接近于優良飼草標準指數[39]。

表1 低溫下2種牧草生理指標與總生物量的線性回歸分析

**:<0.01;***:<0.001

表2 旋扭山綠豆和紫花大翼豆對低溫脅迫的抵抗力指數

**:<0.01;=4

3 討論和結論

3.1 低溫脅迫對葉綠素熒光參數的影響

低溫使植物利用光能的能力降低，而這種變化可通過測定葉綠素熒光簡便快速地反映出來。Fv/Fm是植物在暗適應狀態下的PSⅡ最大光化學量子產量，反映了PSⅡ反應中心內稟光能轉換效率，即PSⅡ最大的光能轉換效率[40]。Yield表示植物光合作用的實際光化學量子效率，能夠反映植物的PSⅡ反應中心在部分關閉情況下的實際原初光能捕獲效率[41]。ETR反映了植物葉片的表觀光合電子傳遞速率，與植物的凈光合速率呈正相關[42]。本研究表明，低溫脅迫下，旋扭山綠豆的Fv/Fm、Yield、ETR均隨低溫脅迫時間的延長而顯著下降，表明低溫脅迫導致PSⅡ反應中心受損，旋扭山綠豆利用光能的能力降低，葉片PSⅡ的受傷害程度隨處理時間的延長而加劇，進一步影響了光能轉化為電勢能,使葉綠體光合鏈上電子傳遞速率受到抑制，ETR和Yield變小，這與廖德寶等[43]對廣西帽兒山的常綠和落葉闊葉林的研究結果一致。吳雪霞等[42]對茄子()幼苗的研究也表明，低溫脅迫導致Fv/Fm下降，且下降趨勢隨著脅迫時間的延長而加劇；孫蓓育等[44]對南美蟛蜞菊()和蟛蜞菊()的研究也表明低溫脅迫導致Fv/Fm、Yield、ETR顯著下降。本研究中，低溫處理使旋扭山綠豆的Yield和 ETR下降幅度顯著低于紫花大翼豆，顯示旋扭山綠豆受低溫影響較小。

3.2 低溫脅迫對葉片抗氧化酶活性的影響

3.3 低溫脅迫對葉片滲透調節物質含量的影響

低溫逆境一方面會降低植物對水分的吸收,造成植物細胞水分虧缺，另一方面會主動積累親水性滲透物質，從而維持細胞滲透平衡以適應脅迫生境[10]。Pro和可溶性糖被認為是植物體內主要的滲透調節保護物質。已有的研究表明低溫脅迫可誘發植物體內脯氨酸和可溶性糖大幅度升高來提高自身對逆境的適應性[11-13]，Pro與可溶性糖的積累與植物的抗寒性呈顯著正相關[13,49-51]。張尚雄等[52]對3種披堿草屬牧草抗寒性的研究也表明，Pro和可溶性糖含量隨低溫脅迫程度的加劇而逐漸增加。本研究中，旋扭山綠豆的Pro和可溶性糖含量在低溫處理后顯著增加，說明他們在應對低溫脅迫造成的傷害時，起到了平衡細胞代謝、提高植物保水能力的重要作用，從而增強了自身的抗寒性。而且,低溫下旋扭山綠豆葉片中的Pro和可溶性糖含量分別提高5.24和1.41倍，分別約為紫花大翼豆增幅的1.64和1.83倍。因此從滲透調節物質來看,旋扭山綠豆的抗寒性更強。

3.4 回歸分析與抵抗力指數分析

回歸分析顯示，低溫下2種牧草的葉綠素熒光參數(Yield和ETR)、抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)和滲透調節物質(Pro和可溶性糖含量)與總生物量呈極顯著正相關，表明他們可用于指示植物的耐寒性。抵抗力指數的變化范圍是-1~+1，值越大表明抵抗力越強，能夠抵抗外界脅迫的能力越強, +1表示脅迫對植物完全沒有影響(抵抗力最大)[37]。在低溫處理下，旋扭山綠豆的Fv/Fm、SOD及POD的抵抗力指數與紫花大翼豆沒有顯著差異，說明Fv/Fm、SOD和POD不能較好地區分旋扭山綠豆和紫花大翼豆對低溫脅迫的抵抗力。但旋扭山綠豆的Yield、ETR、CAT、Pro和可溶性糖的抵抗力指數顯著高于紫花大翼豆，說明旋扭山綠豆主要是通過調節Yield、ETR、CAT活性和滲透調節物質含量來適應低溫脅迫，這與回歸分析的結果基本一致。然而生態穩定性是由抵抗力和恢復力2個部分組成的[53]，本文僅研究了旋扭山綠豆的抵抗力指數，未驗證其恢復力指數，這是本文的不足之處，尚需進一步研究。

不同種的生物學特性(生長、某些抗氧化酶及滲透調節物質等)差異很重要，正是因為這些差異決定了它們應對低溫脅迫的能力。同時本研究是在低溫控制條件下的短期試驗，生長條件與野外環境存在一定的差距，因此需要進一步的野外試驗驗證才能保證在實際應用中的科學性。

3.5 兩種牧草的營養成分比較

牧草營養成分的種類和數量直接關系到牲畜的產量與質量，是評價牧草品質優劣的重要依據,尤其是有效營養成分(粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分和無氮浸出物)[54]。牧草中的粗蛋白是草食牲畜體蛋白的主要來源，而粗脂肪和無氮浸出物是家畜能量的主要來源，同樣牧草中適量的粗纖維含量有利于家畜對食物的消化[54]，另一方面粗灰分含量及其元素組成也很重要[55]。一般認為，粗蛋白、粗脂肪、無氮浸出物和灰分的含量越高，則營養價值越高; 而粗纖維含量越低的牧草，其飼用價值越高[55]。旋扭山綠豆的粗蛋白、粗脂肪、無氮浸出物和灰分的含量都較紫花大翼豆高，且粗纖維只有紫花大翼豆的55%，有研究表明旋扭山綠豆的必需氨基酸齊全，胡蘿卜素和抗壞血酸含量較高和動物所需要的主要微量元素，尤其是鐵、錳、鋅含量較高[18]，因此綜合來說，旋扭山綠豆的營養價值高于紫花大翼豆。

綜上所述，引進品種旋扭山綠豆是一種抗寒性與營養價值均優于紫花大翼豆的優良牧草品種。因而在南方各省推廣旋扭山綠豆具有良好的應用前景。同時，葉綠素熒光參數(Yield和ETR)、CAT與滲透調節物質(Pro和可溶性糖)可以快速、準確地反映植物冷害，建議將其作為旋扭山綠豆耐寒性鑒定的重要生理指標。

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Physiological Response of High Quality Forageto Low Temperature Stress and Rapid Identification of Its Cold Tolerance

YU Han-xia1, JIANG Chao-yang1, WANG Chun1, LIN Yi-han2, JI Ya-ping1, LI Wei-hua1*

(1. School of Life Sciences, South China Normal University, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Southern China Forage, Key Laboratory of Ecology and Environmental Sciences in Guangdong Higher Education,Guangzhou 510631, China; 2. Agriculture Victoria, AgriBio, Centre for AgriBioscience, Victoria 3086, Australia)

In order to rapidly identify the tolerance to low temperature of, the physiological response to low temperature stress (4℃) was studied by comparing with, a high quality forage widely planted in southern provinces in China. The results showed that under low temperature stress, the effective quantum yield (Yield) and electron transfer rate (ETR) from the 2nd to 8th day decreased significantly inthan those in(<0.05). The superoxide dismutase (SOD) activity increased and catalase (CAT) activity decreased significantly (<0.05) for bothandunder low temperature stress. Specifically, the decrease of CAT activity inwas lower than that in. The peroxidase (POD) activity ofdid not change (>0.05) under low temperature, while POD activity indecreased by 47.11%. The contents of free proline (Pro) and soluble sugar were significantly higher inthan those in(<0.05) under low temperature. According to regression analysis, resistance index and nutrient composition analysis,was superior toin cold resistance and nutritional value. Furthermore, Yield, ETR, CAT, Pro and soluble sugar ofcould be used asimportant physiological indexes for identification of cold tolerance.

; Biomass; Chlorophyll fluorescence parameters; Peroxidase; Free proline; Soluble sugar; Low temperature

10.11926/jtsb.4046

2019-01-25

2019-03-11

廣東省自然科學基金項目(2016A030313424)；華南師范大學研究生創新計劃項目(2018LKXM017)；國家重點研發計劃項目(2017YFC1200105)資助

This work was supported by the Natural Science Foundation of Guangdong (Grant No. 2016A030313424), the Graduate Innovation Program of South China Normal University (Grant No. 2018LKXM017), the National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFC 1200105).

余涵霞(1993~ ), 女, 碩士研究生, 主要從事植物生理與土壤微生物方向的研究。E-mail: 1053932574@qq.com

Corresponding author. E-mail: whli@scnu.edu.cn