ARHGAP12在小鼠戊四氮癲癇模型中的表達

劉 華，羅 忠，唐世容

癲癇是神經系統中的常見病，而其中30%為難治性癲癇[1～3]。癲癇因其所帶來的對患者個人、家庭和社會不良后果，已越來越受到公眾的關注[4]。然而，癲癇的具體發生機制仍未完全明確[5]。因此，在癲癇的防治中，探索其發病機制起著舉足輕重的作用。既往研究已明確神經系統興奮和抑制的失衡與癲癇的發生密切相關，其中突觸結構和功能的改變尤為關鍵。Rho是GTP結合蛋白的亞家族，是細胞骨架肌動蛋白的關鍵調控因子，在突觸發育和可塑性中起著關鍵作用[6]。Rho GTP酶激活蛋白12(Rho GTPase-activating protein 12，ARHGAP12)為Rho家族成員之一，為了解ARHGAP12是否參與了癲癇的形成，我們進行了本研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 本實驗采用C57BL/6清潔級(SPF)雄性成年小鼠(體重20～24 g，周齡8～10 w)。所有實驗小鼠均由重慶醫科大學實驗動物中心供給，隨機分為實驗組和對照組。所有動物實驗程序嚴格遵循動物倫理學有關要求，并獲得實驗動物倫理委員會批準。動物在清潔級的標準化實驗環境下分籠飼養(5只/籠)：按自然晝夜節律給予光照循環，溫度恒定(23±1)℃，可自由攝取標準飼料和飲水(SPF級)。

1.1.2 試劑 戊四氮 (pentylenetetrazol，PTZ) (Sigma 公司)；Western blot相關試劑； 兔抗ARHGAP12、兔抗GAPDH、HRP標記的山羊抗兔IgG (Proteintech 公司)；免疫組化試劑盒 (博士德生物工程有限公司)； 豚鼠抗MAP2(SYSY公司)；小鼠抗 GFAP(Proteintech 公司)；山羊抗豚鼠 Dylight633(Abcam公司)；山羊抗兔AlexaFluor488、山羊抗小鼠AlexaFluor594 (碧云天公司)。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組及造模 將小鼠隨機分為PTZ 組(n=15)和對照組(n=10)。PTZ組小鼠隔天腹腔注射PTZ(35mg/kg)共15次，對照組小鼠在同一時間腹腔注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。PTZ注射后觀察行為學30 min，采用Racine評分[7]。記錄發作級別，連續3次出現III級及其以上癲癇發作的小鼠被認為模型點燃成功。腹腔注射15次后小鼠在4%水合氯醛(10 ml/kg) 麻醉下進行斷頭取海馬備用后續實驗。

1.2.2 標本的制備 用于Western blot實驗的小鼠海馬標本參照總蛋白提取試劑盒說明書提取各組蛋白，成功提取的蛋白儲存于-80℃備用。用于免疫熒光實驗的小鼠標本制備冰凍切片后儲存于-20 ℃備用(片厚10 μm)。用于免疫組織化學染色實驗的小鼠標本制備石蠟切片后常溫儲存備用(片厚5 μm)。

1.2.3 Western blot檢測ARHGAP12的表達 蛋白標本上樣于SDS-PAGE凝膠電泳系統，采用BIORAD儀器進行電泳和電轉，成功轉至PVDF膜上后用8%的脫脂奶粉常溫下封閉1 h。 用兔抗ARHGAP12 (1∶1000)和兔抗GAPDH(1∶3000)一抗4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min。次日，用HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶3000)4 ℃孵育1 h。TBST洗膜后運用化學增強發光顯色，用Fusion軟件分析吸光度值，通過Prism軟件對ARHGAP12/GAPDH的比值進行統計。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測ARHGAP12的表達 按照免疫組織化學染色試劑盒說明書進行染色后，用全自動顯微鏡在400倍下拍照，通過 ImageProPlus6.0軟件分析并計算出ARHGAP12積分及光度值與面積的比值(IA/Area)。

1.2.5 免疫熒光染色檢測ARHGAP12的定位 從-20 ℃冰箱取出冰凍切片，用丙酮浸泡半小時。用PBS洗3次，每次3 min。滴加0.4%Triton 37 ℃恒溫箱中破膜15 min。 PBS清洗3 min×3次后，切片浸泡于檸檬酸抗原修復液中，放入微波爐中(高火3 min，低火10 min)。室溫自然冷卻后PBS清洗3 min×3次。 滴加抗原修復液后放入37 ℃恒溫箱中修復15 min。 PBS清洗3 min×3次后，滴加山羊血清封閉液37 ℃置于恒溫箱中封閉2 h。 滴加兔抗ARHGAP12 (1∶50)、豚鼠抗MAP2 (1∶200)和小鼠抗 GFAP (1∶50)，4 ℃過夜。次日，37 ℃復溫1 h。PBS清洗5 min×5次后，避光滴加山羊抗兔AlexaFluor488、山羊抗豚鼠 Dylight633、山羊抗小鼠AlexaFluor594混合物，37 ℃孵育1 h。PBS清洗5 min×5次后1∶1甘油封片。共聚焦顯微鏡采集圖像。

2 結 果

2.1 動物行為學實驗結果 PTZ組小鼠(n=15)隔天腹腔注射PTZ(35 mg/kg)共15次，注射后觀察行為學半小時，采用Racine評分[8]。記錄發作級別，連續3次出現III級及其以上癲癇發作的小鼠被認為模型點燃成功，結果點燃10只納入PTZ組斷頭取海馬備用后續實驗，死亡2只、未點燃3只，淘汰出組。對照組小鼠(n=10)在同一時間腹腔注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液，腹腔注射15次均無癲癇發作，無死亡，納入對照組斷頭取海馬備用后續實驗。

2.2 Western blot檢測結果 ARHGAP12在PTZ癲癇小鼠的海馬組織中的表達較正常對照組顯著增高，具統計學差異(見圖1)。

2.3 免疫組化檢測結果 ARHGAP12在PTZ癲癇小鼠的海馬組織中的表達較正常對照組顯著增高，具統計學差異(見圖2)。

2.4 ARHGAP12 在小鼠海馬組織中的表達 ARHGAP12在小鼠海馬中定位于神經元細胞的胞膜，在星型膠質細胞中未見表達(見圖3)。

圖1 ARHGAP12在小鼠海馬中的表達情況。a：western blot檢測在癲癇組和對照組海馬中ARHGAP12的表達示意圖。b：在癲癇組和對照組海馬中ARHGAP12的表達統計圖，ARHGAP12在癲癇小鼠的海馬中較對照組顯著增高(*P<0.05)

圖2 ARHGAP12在小鼠海馬中的表達情況。a：免疫組化檢測在癲癇組和對照組海馬中ARHGAP12的表達示意圖。b：在癲癇組和對照組海馬中ARHGAP12的表達統計圖，ARHGAP12在癲癇小鼠的海馬中較對照組顯著增高(**P<0.01)

圖3 ARHGAP12在小鼠海馬中的定位情況。a：在小鼠海馬CA1中ARHGAP12表達于神經元細胞的胞膜，在星型膠質細胞中未見表達。b：在小鼠海馬CA3中ARHGAP12定位于神經元細胞的胞膜而非星型膠質細胞。c：在小鼠海馬DG中ARHGAP12與神經元細胞的胞膜共表達，與星型膠質細胞中無共表達

3 討 論

ARHGAP12是ARHGAP家族成員之一，ARHGAP家族基因編碼具有Rho GAP結構域的Rho/Rac/Cdc42樣GTP酶活化蛋白，其屬于Ras超級小GTP酶家族，其功能是在活性GTP結合形式和無活性GDP結合形式之間循環的分子開關[9]。Rho樣GTP酶參與細胞內反應，包括細胞骨架肌動蛋白的調節、細胞極性的控制、微管動力學、膜轉運和轉錄調節[10]。作為細胞骨架肌動蛋白的關鍵調節劑，GTP結合蛋白的Rho亞家族在突觸發育和可塑性中起關鍵作用，而調節突觸效應的關鍵機制涉及樹突棘的大小和數量的動態變化，以及突觸膜上膜下AMPA型谷氨酸受體(α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，AMPAR)的動態變化[6]。

AMPAR是一種離子型谷氨酸受體，是包含GLUR1、GLUR2、GLUR3和GLUR4四種亞單位的四聚體[11]。AMPARs介導興奮性信號在中樞神經系統中的快速傳遞，其機制主要為AMPARs與興奮性突觸后致密物PSD95結合，通過蛋白質相互作用連接其他信號分子，以及蛋白質翻譯后修飾，從而增強突觸后興奮電流，介導興奮性突觸傳遞[12，13]，在癲癇的發病機制和發展中起著重要作用[14]。AMPARs在突觸膜上下移位是一個動態變化的過程，受體內吞后一部分被溶酶體吞噬降解，另一部分在內質網再組裝后通過胞吐回到突觸膜上，發揮其興奮性突觸傳遞的功能。AMPARs在突觸膜上數量的改變可引起中樞神經系統興奮性的改變[15]。

Ba等人發現ARHGAP12特異性表達于海馬體CA1區，定位于突觸后興奮性突觸區[16]。本研究驗證了ARHGAP12定位于小鼠海馬中神經元細胞的胞膜，在星型膠質細胞中未見表達。既往學者發現，ARHGAP12能夠通過調節樹突棘形態和AMPAR在突觸膜上下的數量水平，從而協調突觸效應。ARHGAP12的過度表達降低了樹突棘密度和體積，而敲除ARHGAP12導致樹突棘體積增加而不影響樹突棘密度。在功能上，ARHGAP12水平升高顯著抑制了CA3-CA1興奮性突觸，并且ARHGAP12能夠主動調節興奮性AMPAR內吞作用。一方面，ARHGAP12可調節其靶標Rac1 GTP酶的活性，并隨后調節樹突棘的形態。另一方面，通過與F-BAR蛋白CIP4 (Cdc42-interacting protein 4)相互作用，ARHGAP12參與內吞機制并進一步調節AMPAR內吞作用[6]。因此，ARHGAP12通過限制發育中的海馬體內沉默的突觸轉化為功能性突觸來限制突觸的成熟[16]。本研究通過Western blot 和免疫組化檢測均發現ARHGAP12在PTZ癲癇小鼠海馬組織中較正常對照組的表達顯著增高，具統計學差異。這些結果顯示癲癇發病中ARHGAP12可能存在自我保護性的代償增高，降低樹突棘密度和體積，主動調節興奮性AMPAR內吞，從而控制癲癇的發展。這可能為癲癇的發生發展機制提供了新的思路，但其具體的詳細機制仍需進一步研究。