細(xì)胞焦亡在慢性腦缺血中的研究進(jìn)展

張麗梅，王愷迪綜述，黎 曉審校

慢性腦缺血是指因各種原因所引起的慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的一組疾病。隨著人口老齡化社會(huì)的進(jìn)入，因慢性腦缺血導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、行為能力以及學(xué)習(xí)記憶等功能障礙，給患者和家人帶來了嚴(yán)重的危害[1]。慢性腦缺血的病理生理學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜，主要包括免疫炎性損傷、Ca2+超載、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷、突觸結(jié)構(gòu)和功能異常、線粒體損傷、中樞膽堿能及單胺能系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)功能紊亂等[2]，其中炎癥反應(yīng)在慢性腦缺血方面起重要作用。腦缺血后，炎癥細(xì)胞激活后引起正反饋式的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將大大加重慢性腦缺血引起的神經(jīng)元損傷，而腦白質(zhì)和海馬 CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷都將引起認(rèn)知功能障礙[3]。因此，有效控制炎性反應(yīng)是減輕慢性腦缺血的重要措施 。

細(xì)胞焦亡(pyroptosis)又稱細(xì)胞炎性壞死，是一種由炎癥性半胱天冬酶(caspase)引發(fā)的瓦解式細(xì)胞死亡形式[4]。文獻(xiàn)表明，細(xì)胞焦亡在病毒性感染、艾滋病、動(dòng)脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病、胃癌、白內(nèi)障、酒精性肝炎、慢性嬰兒神經(jīng)性皮膚和關(guān)節(jié)綜合征等疾病均發(fā)揮重要作用。并且有研究稱，細(xì)胞焦亡還參與了慢性腦缺血的損傷過程[5～7]。故而本文擬從細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生機(jī)制及其與慢性腦缺血的關(guān)系等角度進(jìn)行綜述，旨在總結(jié)細(xì)胞焦亡與慢性腦缺血之間的關(guān)系及轉(zhuǎn)歸中的作用，為廣大學(xué)者研究和臨床防治慢性腦缺血提供參考。

1 細(xì)胞焦亡

新近研究認(rèn)為細(xì)胞焦亡是一種新型炎癥細(xì)胞死亡類型，屬于III型程序性細(xì)胞死亡的一種。根據(jù)細(xì)胞焦亡的組裝生成物不同，常分為依賴caspase-1的經(jīng)典炎癥小體途徑和依賴caspase-4.5.11的非經(jīng)典炎癥小體途徑[8]。

1.1 細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征 細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征主要表現(xiàn)為，細(xì)胞發(fā)生腫脹形成凸出物、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增大、質(zhì)膜出現(xiàn)破裂并形成質(zhì)膜孔，其中質(zhì)膜孔的出現(xiàn)常常作為細(xì)胞焦亡發(fā)生的標(biāo)志，此時(shí)細(xì)胞膜失去完整性，細(xì)胞滲透性增高直至細(xì)胞膜破裂，造成一些顆粒和物質(zhì)(熱休克蛋白、炎癥因子、乳酸脫氫酶等)的釋放，引起局部或全身炎癥反應(yīng)[9]；與細(xì)胞凋亡的特征[7](凋亡小體的形成、染色質(zhì)凝聚、核碎裂或核固縮、胞質(zhì)DNA斷裂、細(xì)胞質(zhì)空泡化以及線粒體腫脹等)有著明顯區(qū)別。

1.2 細(xì)胞焦亡炎癥小體的組裝 炎癥小體(inflammasome)由Tschopp等[10]于2002年首次提出，是由胞漿內(nèi)膜識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)參與組裝的一類細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)多蛋白復(fù)合物，分子量約700 KDa，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。炎癥小體的組成成分主要有三種：①NOD樣受體(NOD-like receptors，NLR)家族的上游傳感蛋白。②銜接蛋白ASC(Apoptosi-associated speck-like protein containing a CARD)，該蛋白含有CARD結(jié)構(gòu)域凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白；該蛋白結(jié)構(gòu)較為統(tǒng)一，由PYD-CARD表示。③下游效應(yīng)子pro-caspase-1[11]。在未激活狀態(tài)下，caspase帶有CARD結(jié)構(gòu)域，其蛋白結(jié)構(gòu)式可以由CARD-Caspasedomain表示。在炎癥小體組裝過程下，PYD結(jié)構(gòu)域和ASC的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成同型PYD：PYD相互作用，而ASC中的CARD結(jié)構(gòu)域又可以和效應(yīng)蛋白的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成類似的CARD：CARD相互作用，這樣ASC在這里起到橋梁作用，連接受體蛋白和效應(yīng)蛋白。正常情況下，pro-caspase-1不具有生物活性，但當(dāng)炎性小體激活后pro-caspase-1在細(xì)胞質(zhì)中可轉(zhuǎn)化為異二聚體，并進(jìn)一步組裝成具有生物活性的四聚體caspase-1，后者可剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，使其變成具有生物活性的IL-1β和IL-18，達(dá)到促進(jìn)炎癥因子成熟和分泌的作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激病理?xiàng)l件下發(fā)生細(xì)胞焦亡[12]。

2 參與細(xì)胞焦亡的主要分子

2.1 GSDMD 經(jīng)典途徑中，GasderminD(GSDMD)是gasdermin蛋白家族成員之一，它被認(rèn)為是caspase啟動(dòng)細(xì)胞焦亡的重要介質(zhì)[13]。當(dāng)機(jī)體受到損傷時(shí)，相關(guān)分子模式被觸發(fā)：細(xì)胞膜識(shí)別受體可以檢測到Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)和 NLR，此時(shí)ASC與pro-caspase-1結(jié)合形成多蛋白復(fù)合物，caspase-1被激活進(jìn)而切割GSDMD的氨基端和羧基端的連接體，產(chǎn)生一個(gè)N末端p30片段，p30 GSDMD在切割后結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，可靶向作用于細(xì)胞膜并且誘導(dǎo)在質(zhì)膜中形成大的滲透性孔，因此GSDMD被認(rèn)為是形成細(xì)胞焦亡孔的候選者[14]。有學(xué)者用純化重組的GSDMD進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原子力顯微鏡下觀察到caspase-1切割的重組GSDMD的N-末端片段緊密結(jié)合脂質(zhì)體并形成直徑約20 nm的圓形滲透性孔，GSDMD的N-末端片段足以導(dǎo)致特定形式的細(xì)胞死亡，且具有焦磷酸鹽的形態(tài)學(xué)特征[15]。因此，GSDMD是細(xì)胞焦亡的直接和最終參與者。

2.2 caspase 有研究發(fā)現(xiàn)，caspase-1對(duì)經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡發(fā)生起決定性作用[16]。在經(jīng)典途徑中，機(jī)體出現(xiàn)危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)，炎性復(fù)合體激活caspase-1，激活后的caspase-1主要作用是形成焦亡獨(dú)有質(zhì)膜孔，參與細(xì)胞內(nèi)外離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞水腫而破裂[17]；此外，能使IL-1β和IL-18等促炎因子募集和激活其他免疫細(xì)胞釋放炎癥因子、趨化因子及粘附分子等，從而放大局部和全身炎癥反應(yīng)[18]。此外，caspase(人caspase-4，人caspase-5和鼠caspase-11)在非經(jīng)典途徑中扮演了重要的角色[19]。這些蛋白質(zhì)充當(dāng)細(xì)胞溶質(zhì)模式識(shí)別受體(PRR)，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)損傷(LPS刺激時(shí))，caspase-4.5.11被激活，活化的caspase-4.5.11切割GasderminD，形成氮端活性域的肽段，一方面誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂，釋放內(nèi)容物，另一方面誘導(dǎo)caspase-1的激活擴(kuò)大炎癥反應(yīng)而加劇機(jī)體損傷[20]。因此，caspase與細(xì)胞焦亡有十分密切的聯(lián)系。

3 細(xì)胞焦亡與慢性腦缺血

3.1 細(xì)胞焦亡在慢性腦缺血發(fā)生過程中的作用 炎癥反應(yīng)參與了慢性腦缺血，而細(xì)胞焦亡在炎癥調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，因此，細(xì)胞焦亡與慢性腦缺血之間可能存在著密切聯(lián)系[21]。在發(fā)生慢性腦缺血時(shí)，細(xì)胞通過釋放損傷相關(guān)性分子模式(damage associated molecular patterns，DAMP)和病原體相關(guān)性分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)等信號(hào)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，并觸發(fā)了一系列復(fù)雜的分子反應(yīng)，此時(shí)顱內(nèi)的神經(jīng)免疫炎性細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等出現(xiàn)增生和活化[22，23]。

(1)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。一般認(rèn)為，主要有經(jīng)典激活(classical activation)和選擇性激活(alternative activation)兩種類型，其中M1型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種炎癥因子 TNF-α、IL-1、IL-6 等進(jìn)一步加劇神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)，使神經(jīng)元損傷加重；而M2型極化的小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有抗炎，支持和營養(yǎng)作用。因而研究認(rèn)為，調(diào)整小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)(極化類型)可能作為抗慢性腦缺血損傷治療的靶點(diǎn)事件[24，25]。

(2)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。通常認(rèn)為，激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞可促使其釋放釋放腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素、生長因子等炎癥因子或神經(jīng)元毒性介質(zhì)導(dǎo)致神經(jīng)元的損害[26]；而最新的研究表明，激活后的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加、胞體肥大、突觸增多變粗，其標(biāo)記物 GFAP 的表達(dá)增強(qiáng)，還可出現(xiàn)不同程度的折疊，損傷嚴(yán)重的還可形成膠質(zhì)瘢痕。因此，當(dāng)海馬組織缺血缺氧時(shí)，海馬組織的抗氧化能力將減弱，并可能釋放大量炎癥因子，從而加重對(duì)海馬組織的損傷[27]。有研究表明[28，29]，在SD大鼠局灶腦缺血后 3 h，缺血區(qū)即有IL-1β樣免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞出現(xiàn)，主要系未活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞，直到缺血后2 m，在缺血半球仍可持續(xù)檢測該陽性細(xì)胞，尤以壞死灶周圍明顯，且活化程度愈高。此外，還有觀點(diǎn)認(rèn)為，在caspase-1的作用下引發(fā)的細(xì)胞焦亡過程，可能通過促進(jìn)IL-1β和IL-18等炎癥因子的進(jìn)一步釋放加劇腦組織的炎性損傷，使腦缺血向更嚴(yán)重的程度發(fā)展[30]。

3.1.1 經(jīng)典途徑與慢性腦缺血 GSDMD作為細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白被激活并轉(zhuǎn)移到膜上后可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞破裂，導(dǎo)致更多炎癥介質(zhì)的釋放，從而誘導(dǎo)腦組織損傷和細(xì)胞死亡，這就提示經(jīng)典途徑可能參與了慢性腦缺血等腦組織損傷過程[31]。caspase-1蛋白酶是多蛋白炎性體復(fù)合物的核心成分，它可促進(jìn)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1α，IL-1β和IL-18 等大量促炎因子的釋放，參與內(nèi)在炎癥免疫反應(yīng)[32]。有研究表明[33]，caspase-1低表達(dá)的小鼠可能對(duì)慢性腦缺血有一定保護(hù)作用，說明經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡及其相關(guān)機(jī)制可能加劇了腦缺血的腦損傷。此外，用慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默caspase-1不僅顯著降低了小鼠原代海馬神經(jīng)元中與細(xì)胞焦亡相關(guān)的蛋白質(zhì)的水平，而且還降低了線粒體凋亡相關(guān)蛋白的水平[34]。此外，在大鼠的氧糖剝奪模型中，對(duì)海馬切片的觀察發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-1可以減輕海馬神經(jīng)元的損傷；并且，使用caspase-1抑制劑可以減輕因不依賴于IL-1β誘導(dǎo)的caspase-1所導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡，從而神經(jīng)系統(tǒng)損傷[35](見圖1)。總之，這些研究證明了caspase-1在慢性腦缺血過程中的關(guān)鍵作用。因此，抑制細(xì)胞焦亡中caspase-1活性可能是治療慢性腦缺血的一種新形式。

圖1 PAMP/DAMP信號(hào)刺激下，NOD、ASC和pro-caspase-1裝配成功為多復(fù)合物炎性小體。ASC募集酶原caspase-1，引起自動(dòng)切割和激活。①激活的caspase-1可剪切沒有活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，使其變成具有生物活性的IL-1β和IL-18，促進(jìn)炎癥因子的成熟和分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞在炎性和應(yīng)激的病理?xiàng)l件下死亡；②通過切割GSDMD形成GSDMD的N-末端并在質(zhì)膜中形成孔，誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂

3.1.2 非經(jīng)典途徑與慢性腦缺血 非經(jīng)典途徑信號(hào)分子Caspase-4參與了LPS介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和NLRP3活化過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)的caspase-4也發(fā)現(xiàn)具有促炎功能，但caspase-4并不能直接介導(dǎo)IL-1β的成熟，或者必需與caspase-1協(xié)同起作用[36]，但是在鉀離子的作用下NLRP3活化能使caspase-1成熟并隨后釋放IL-1β等炎癥因子，加劇膠質(zhì)細(xì)胞死亡和腦組織損傷。另一項(xiàng)研究表明，caspase-11的激活促進(jìn)了caspase-1和caspase-3的后續(xù)激活，并且在caspase-11敲除小鼠的MCAO 模型中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞死亡的現(xiàn)象明顯減輕[37]。caspase-11可以檢測細(xì)胞內(nèi)的毒素，促進(jìn)IL-1α釋放，caspase-11還可直接切割gasdermin D導(dǎo)致caspase-1依賴性IL-1β釋放，從而加劇慢性腦缺血的細(xì)胞死亡[38](見圖2)。因此，抑制非經(jīng)典炎癥小體途徑可以緩和腦組織損傷作用。

圖2 LPS等信號(hào)刺激下，pro-caspase-11被激活，一方面，活化的caspase-11切割GSDMD，形成GSDMD的N-末端并在質(zhì)膜中形成焦亡孔，誘導(dǎo)細(xì)胞膜破裂，釋放內(nèi)容物；另一方面激活的caspase-11誘導(dǎo)caspase-1的激活剪切使pro-IL-1β和pro-IL-18變成IL-1β和IL-18，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)而加劇機(jī)體損傷。

3.2 炎癥小體在慢性腦缺血損傷過程中的作用 目前已發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有四種：NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2[39]。雖然大多數(shù)炎性小體具有相同的效應(yīng)分子，但它們通過使用不同的受體蛋白識(shí)別不同的配體而發(fā)揮各自獨(dú)特的作用。NLRP3 是研究最多且最具特征的炎性小體，屬于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體，在慢性腦缺血的發(fā)病機(jī)制中起著十分的重要作用[40]，NLRP3含有PYD、NACHT、LRR三個(gè)結(jié)構(gòu)域，可由LRR-NACHT-PYD：PYD-CARD：CARD-CARD-Caspasedomain表示，并對(duì)內(nèi)源性損傷的各種信號(hào)作出應(yīng)答，故而認(rèn)為NLRP3炎癥小體的激活是引起細(xì)胞焦亡的主要類型[41]。

已有研究證明，NLRP3炎癥小體參與了慢性腦缺血的發(fā)生發(fā)展過程。由于NLRP3在大腦和免疫細(xì)胞中大量表達(dá)，可“感知”缺血缺氧引起的刺激信號(hào)，故激活NLRP3可促進(jìn) capase-1 前體轉(zhuǎn)化為capase-1，進(jìn)而促進(jìn)缺血腦組織中神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，并通過IL-1β和IL-18等促炎因子的產(chǎn)生與釋放加重神經(jīng)炎癥，繼而影響腦梗死的預(yù)后[42～45]。另有研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血相關(guān)白質(zhì)的損害與炎癥密切相關(guān)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在白質(zhì)或海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)明顯升高[46]，同時(shí)，IL-1β表達(dá)增多時(shí)可以促進(jìn)興奮性氨基酸毒性和氧化毒性，進(jìn)而加劇腦缺血和腦白質(zhì)損害[47]，這些證據(jù)表明，細(xì)胞焦亡參與了慢性腦缺血的過程[48，49]。此外，在腦缺血離體模型的研究發(fā)現(xiàn)，通過遺傳調(diào)節(jié)抑制NLRP3后，可以有效控制神經(jīng)炎癥的發(fā)生，同時(shí)緩解大腦線粒體功能障礙，進(jìn)而減輕缺血性腦損傷和減少神經(jīng)血管并發(fā)癥的發(fā)生。因此，抑制NLRP3炎癥小體的形成，可為研究和治療慢性腦缺血損傷提供新思路。

4 展 望

細(xì)胞焦亡在腦缺血中的重要性越來越受到關(guān)注。以上證據(jù)表明，細(xì)胞焦亡和炎癥小體參與了慢性腦缺血，我們或許可以通過阻斷或抑制炎癥小體的組裝、活性和(或)表達(dá)，進(jìn)而抑制caspase-1(或caspase4/5/11)的激活，從而減少炎癥因子的釋放，達(dá)到減輕腦損傷的治療目的。此外，我們是否也可通過阻斷或抑制GSDMD的活性和表達(dá)，使細(xì)胞不形成質(zhì)膜孔，阻止細(xì)胞發(fā)生焦亡，這或許是腦缺血治療的新機(jī)制。因此，尋找各類新型caspase抑制劑和GSDMD抑制劑可能為挽救神經(jīng)損傷提供新的保障，繼續(xù)深入探究細(xì)胞焦亡機(jī)制和進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其在慢性腦缺血進(jìn)程中的作用，將會(huì)為臨床治療提供新的思路及全新的藥物靶點(diǎn)。