CP-25抑制GRK2-ERK信號調節血管內皮細胞遷移和成管功能

程琢玉，嚴尚學，魏 偉

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以滑膜增生、血管翳形成為特征的自身免疫性疾病。新生血管形成是RA發展過程中的早期事件[1]。新生血管為關節滑膜細胞提供營養和氧氣[2]，招募細胞炎癥因子，引起滑膜組織的增生，形成血管翳，致關節畸形。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是重要的促炎介質，在RA過程中發揮著重要的作用[3]。Ang Ⅱ可以通過Ang Ⅱ-AT1R-ERK1/2信號通路加強佐劑性關節炎(CIA)大鼠血管損傷[4]。

新藥芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)是芍藥苷的新型衍生物，具有良好的抗炎免疫調節活性。研究[5]表明，CP-25可以減輕CIA小鼠關節滑膜炎性細胞浸潤、滑膜增生以及滑膜炎癥，血管翳形成，提示CP-25可有效抑制大鼠新生血管形成。本實驗擬以人臍帶靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為對象，觀察CP-25體外對其功能的影響及其相關作用機制，為進一步了解RA的病理機制及發現新的作用靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器Ang Ⅱ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、Matrigel基質膠(美國Sigma公司)；8 μm Transwell小室(美國Corning公司)；兔來源抗人AngⅡ 1型受體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)單克隆抗體(美國Abcam公司，批號：ab9391)；p-ERK1/2抗體(美國CST公司，批號：8544)；p-IκBα抗體(美國CST公司，批號：4025)；G蛋白偶聯受體激酶2 (G-protein-coupled receptor kinase 2，GRK2)抗體(美國CST公司，批號：3982S)；β-actin抗體(北京博奧森生物有限公司，批號：bs-0061R)；HUVEC由安徽醫科大學基礎醫學院朱華慶教授課題組惠贈；芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)由安徽醫科大學臨床藥理研究所合成。

1.2 方法

1.2.1HUVEC的培養 鋪路石樣的HUVEC長至培養瓶的90%單層，此時傳代。傾棄培養基，用無菌的PBS溶液洗2～3次，加入1 ml消化液。在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，倒去消化液并加入含10%胎牛血清DMEM培養液終止反應。用一次性吸管將細胞吹打下來，取一半細胞液傳至另一無菌培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2.2CCK8法檢測細胞的增殖 課題組前期實驗表明，TNF-α刺激HUVEC增殖的亞適濃度為5 ng/ml，作用最強在24 h；Ang Ⅱ(1×10-9、 1×10-8、 1×10-7、 1×10-6mol/L)刺激HUVEC均可使細胞數目顯著增高，最適濃度為10-7mol/L，作用最強在24 h。TNF-α(5 ng/ml)和Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)聯合使用可促進HUVEC增殖功能[6]。HUVEC消化后，以1.5×104細胞/孔種到96孔板中。分別設對照組、TNF-α+Ang Ⅱ組、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組作用24 h，終止培養前每孔加入10 μl CCK8試劑室溫下震蕩30 s混勻后繼續培養1～3 h。肉眼觀察細胞孔中顏色由黃色變成深橙色，于酶標儀中讀取波長450 nm處的吸光度值(A)，結果以3個復孔的均值表示。

1.2.3transwell小室法檢測細胞的遷移 預先用對照組、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、 1×10-5mol/L) 處理24 h的HUVEC，用胰酶消化后制備成1×105/ml的細胞懸液，取100 μl加入無菌的8 μm的transwell小室上室，下室加入含20% FBS的培養液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。第2天取出小室，用棉簽輕輕擦去內面未遷移的細胞，下室已遷移的細胞用20%甲醇配制的結晶紫室溫下染色10 min。顯微鏡檢遷移細胞數，4倍鏡視野統計細胞數目。

1.2.4HUVEC的成管實驗 Matrigel基質膠溶解后4 ℃環境下取55 μl包被于96孔板中，室溫平衡30 min，37 ℃凝膠60 min。預先對照組、TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)處理24 h的HUVEC，胰酶消化，用2% FBS的DMEM培養液制備細胞懸液。以1×104個細胞/孔的密度種到Matrigel膠上，將96孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育6 h后每隔2 h在顯微鏡下觀察細胞的成管狀況并拍照。4倍顯微鏡下統計成管數目。

1.3 Western blot檢測HUVEC相關蛋白的表達HUVEC加入6孔板中培養至90%時，分別加入TNF-α+Ang Ⅱ、TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)培養24 h。棄去培養液后加入100 μl裂解液于冰上裂解30 min后，收集蛋白，預處理后，每孔30 μg蛋白加入10% SDS-PAGE凝膠電泳孔中電泳、轉膜。室溫封閉后，加入抗AT1R抗體、抗GRK2抗體、抗p-ERK抗體、抗p-IκBα抗體或β-actin抗體4 ℃過夜。辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育2 h后。采用凝膠成像系統掃描結果后，Image J軟件分析以目的蛋白條帶在相同面積下的灰度值為有效值，反映蛋白表達水平。

2 結果

2.1 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α聯合誘導的HUVEC增殖功能的影響與對照組(1.06±0.10)相比,Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進HUVEC增殖功能(1.50±0.11)，差異有統計學意義(F=6.74，P<0.05)。與Ang Ⅱ(1×10-7mol/L)+TNF-α(5 ng/ml)組相比，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組作用24 h，細胞增殖反應無明顯影響(P>0.05)。見圖1。

圖1 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α誘導的HUVEC增殖的影響

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較:*P<0.05

2.2 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯合誘導的HUVEC遷移功能的影響與正常組比較(67.36±32.15)，Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進HUVEC遷移功能(190.00±11.50)，差異有統計學意義(F=34.06，P<0.01)；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥作用24 h可抑制其誘導的HUVEC的遷移能力，與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且不同濃度間的CP-25的抑制遷移作用沒有顯著性差異(P>0.05)。見圖2。

2.3 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯合誘導的HUVEC成管功能的影響與正常組比較，Ang Ⅱ+TNF-α組給藥作用于HUVEC 24 h后，可以促進HUVEC成管功能(367.90±48.19)，差異有統計學意義(F=31.24，P<0.01)；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥作用24 h可抑制其誘導的HUVEC的成管能力(P<0.05，P<0.01)，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6mol/L)抑制成管作用最強(P<0.01)。見圖3。

2.4 CP-25對Ang Ⅱ和TNF-α 聯合誘導的HUVEC相關信號蛋白表達的影響與Ang Ⅱ+TNF-α組比較，TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥可以降低AT1R蛋白(F=4.11，P<0.05，P<0.01)、GRK2蛋白(F=14.00，P<0.05，P<0.01)表達水平。TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-7、1×10-6mol/L)組給藥明顯降低HUVEC內Ang Ⅱ+TNF-α組給藥誘導活化的p-ERK1/2蛋白(F=13.53，P<0.05，P<0.01)的表達水平，而TNF-α+Ang Ⅱ+CP-25(1×10-6、1×10-5mol/L)組給藥降低HUVEC內Ang Ⅱ+TNF-α組給藥誘導活化的p-IκBα蛋白(F=8.61，P<0.05，P<0.01)的表達水平，見圖4。

圖2 CP-25 對Ang Ⅱ和TNF-α誘導的HUVEC遷移的影響×40

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較：**P<0.01；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：#P<0.05

圖3 CP-25 對Ang Ⅱ和TNF-α誘導的HUVEC成管的影響×40

A：正常組；B：Ang Ⅱ+TNF-α組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；E：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與正常組比較：**P<0.01；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖4 CP-25對Ang Ⅱ與TNF-α聯合刺激的HUVEC細胞 AT1R、GRK2、p-ERK、p-IκBα表達的影響

A：Ang Ⅱ+TNF-α組；B：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-7mol/L)組；C：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-6mol/L)組；D：Ang Ⅱ+TNF-α+CP-25(1×10-5mol/L)組；與Ang Ⅱ+TNF-α組比較：▼P<0.05,▼▼P<0.01

3 討論

新生血管生成是由原有的血管形成新的毛細血管，隨著對氧氣和營養物質需求的增加，它在缺血/缺氧組織中更為常見。生理性血管生成在胚胎發育、創面愈合等過程中起著不可缺少的作用，但是不受控制的病理性血管生成在RA滑膜炎中發揮了重要作用。在炎癥早期階段，RA患者關節滑膜內分泌大量TNF-α、前列腺素E、IL-1等促血管因子，激活內皮細胞促進其增殖遷移，形成新生微血管[7]。這些新血管為肥厚關節滑膜細胞提供營養和氧氣[2]，并招募細胞因子和炎癥因子浸潤滑膜，引起滑膜組織的增生，這種惡性循環最終形成血管翳，引起滑膜炎癥以及骨和軟骨的破壞，最終導致關節畸形及功能障礙。在RA血管生成和血管翳形成過程中，血管內襯的血管內皮細胞是各種細胞因子發揮作用的重要靶點，例如血管生成介質、生長因子、滲透因子、基質降解酶等作用因子[8]。這些因子作用于內皮細胞，導致內皮基底膜和滑膜細胞外基質的降解，最終促進血管翳的形成[9]。由于滑膜血管翳內的內皮細胞難以分離出來作為研究對象，本實驗選取HUVEC作為替代研究對象，觀察了CP-25對其增殖、遷移以及體外成管的作用。研究[10-11]表明，Ang Ⅱ及TNF-α都參與了RA疾病的病理進程。而且在課題組前期預實驗發現，Ang Ⅱ刺激HUVEC增殖的最適濃度是10-7mol/L，TNF-α刺激HUVEC增殖的適宜濃度是5 ng/ml。本實驗結果顯示，經Ang Ⅱ(10-7mol /L)和TNF-α(5 ng/ml) 聯合刺激后HUVEC的增殖、遷移與成管能力顯著增強，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)體外給藥可明顯抑制TNF-α和Ang Ⅱ聯合誘導的HUVEC遷移與成管反應，但對其增殖作用無顯著影響。

白芍總苷(total glucosides of paeony, TGP)是臨床治療RA的主要藥物，以其主要生物活性成分芍藥苷結構修飾改造合成的新藥芍藥苷-6′-O-苯磺酰酯(代號CP-25)具有良好的抗炎免疫調節活性。研究表明，CP-25可以減輕CIA小鼠關節滑膜炎性細胞浸潤、滑膜增生以及滑膜炎癥，抑制淋巴細胞活化，下調白介素2(IL-2)和白介素17(IL-17)的水平，改善脾臟病理變化[5]；CP-25還可抑制人的活化B細胞的功能[12]，通過調節炎癥和骨損傷的免疫介質來預防自身免疫性關節炎[13]。

由于ERK信號通路通過激活細胞核轉錄因子(NF-κB)調節細胞因子水平與細胞增殖、遷移緊密相關，因此檢測AngⅡ和TNF-α聯合使用以及CP-25 (1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L)對HUVEC p-ERK、p-IκBα 等蛋白的表達變化。結果顯示，與Ang Ⅱ和TNF-α聯合給藥組相比，CP-25(1×10-7、 1×10-6、 1×10-5mol/L)體外給藥可顯著降低HUVEC的GRK2蛋白表達水平，明顯降低AT1R、p-ERK和p-Ikβα的蛋白表達。AT1R為G蛋白偶聯受體(GPCRs)，可被G蛋白偶聯受體激酶2(GRK 2)調控。GRK 2屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族(GRKs)成員，可以磷酸化受體蛋白，參與受體的內吞和脫敏過程。它的異常表達與多種炎癥疾病有關。本實驗提示CP-25可能通過減弱GRK 2的表達從而調控ERK1/2-NF-κB來抑制RA的發生。