pEGFP-N1-IL-17通過調控Fas/FasL信號通路影響喉癌Hep-2細胞的凋亡

張紅健，宋 楊，楊 明，季加標，楊見明

頭頸部有一種發病率較高的腫瘤，以鱗狀細胞癌為主，就是喉癌[1]。喉癌在臨床治療上主要以手術或者手術聯合放化療方式，會不同程度地影響患者的喉功能和生活質量都會大大下降。所以必須研究更多的像免疫治療這類的方法來治療喉癌[2]。白介素-17(IL-17)是CD4+T Th17等細胞分泌的一種細胞因子[3]。IL-17的相關研究主要集中在腫瘤疾病方面[4]。還有研究[5]顯示Lewis肺癌荷瘤小鼠的MDSCs細胞的凋亡也是可以被IL-17抑制的。也有研究[6]表明Fas 又稱 Apo-1 或 CD95 分子，屬于腫瘤壞死因子受體家族類，為 Fas 配體( FasL)的受體，Fas與FasL的結合，促進細胞凋亡[7]。有相關研究[8-9]顯示喉癌組織中Fas和FasL的表達是下降的，說明存在某些細胞因子阻斷Fas介導的凋亡途徑。研究[6]表明，IL-17可以通過IL-6/IL-6R/JAK1/STAT3通路來調控Hep-2細胞的侵襲和轉移。

1 材料與方法

1.1 細胞培養喉癌細胞(Hep-2細胞)購自南京凱基生物科技發展有限公司。細胞培養基(DMEM+青霉素+鏈霉素+10%胎牛血清)，用5%的CO2細胞培養箱在37 ℃條件下培養。Opti-MEM(×1)和Lipofectamine 2000均購于美國Life Technology公司。

1.2 試劑Opti-MEM培養基、TRIzol Reagent購于美國Invitrogen公司；血清購自美國Hyclone公司；總RNA提取試劑盒購于德國Qiagen公司。pEGFP-N1-IL-17購于武漢金凱瑞生物工程有限公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM培養液購于美國HyClone公司；抗PI3K單克隆抗體和抗p-PI3K抗體均購于美國Abcam公司。抗FasL抗體和抗Fas抗體均購于美國CST公司；Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8抗體均購于美國Immunoway公司；抗β-actin 抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司；山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購于美國ABclonal公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司；蛋白 Marker、ECL熒光劑(顯影劑)胰酶、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA法蛋白濃度檢測試劑盒均購于上海碧云天生物有限公司；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix購自北京TaKaRa Clontech公司；擴增引物購自上海生工生物工程股份有限公司；熒光染料Maxima SYBR Green/ROX qPCR購自美國Thermo公司。

1.3 儀器超凈工作臺(型號：SW-9800)購于蘇州泰安空氣技術有限公司。恒溫細胞培養箱(型號：NAPCO-8800)購于美國SHELLAB公司；CytoFLEX流式細胞儀(Tanon)購自美國BECKMAN COULTER公司；Western blot 電泳儀購于上海天能科技有限公司；逆轉錄反應儀器購自美國ABI公司；Mastercycle epgradient Eppendorf PCR 擴增儀購自德國Eppendorf公司。

1.4 qRT-PCR法檢測重組質粒IL-17(pEGFP-N1-IL-17)轉染喉癌Hep-2細胞后IL-17的表達收集轉染的細胞加1 ml TRIzol試劑，提取總RNA。(提取六孔板每個孔中RNA，加水配到8 μl)：在37 ℃溫度條件下進行逆轉錄反應15 min。每組有3個復孔。反應條件：95 ℃、20 s預變性，循環內95 ℃、10 s變性，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共設置40個循環，然后設置(95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s)反應步驟。擴增完成之后采用ΔCt法分析定量結果。

1.5 IL-17過表達重組質粒的構建與鑒定結構序列設計合成2對引物：第1對引物位于IL-17cDNA的起始密碼和終止密碼前后端，兩側分別含AgeI酶切位點，用于PCR釣取擴增目的基因：正義鏈5′-CGCTGATGGGAACGTGGACTAC-3′和反義鏈5′-GGTGGACAATCGGGGTGACA-3′。第2對引物根據目的基因及載體本身序列設計，用于鑒定IL-17定向連接的陽性克隆菌落以及測序，通過PCR擴增獲得目的基因IL-17cDNA片段，純化后經Age I酶切消化。用Age I酶酶切載體質粒、回收線性載體片段。用T4噬菌體DNA連接酶將IL-17線性化載體連接，再轉化、涂板、挑取克隆、擴增，試劑盒提取質粒，酶切，最后用PCR凝膠電泳鑒定，再測定序列。通過運用PCR法，從質粒中將人IL-17cDNA擴增，并將其成功插入pEGFP-N1載體中，經過測序和驗證之后，pEGFP-N1-IL-17載體成功構建。把質粒pEGFP-N1和PCR產物進行雙酶切(BamH I和EcoR I)，再用T4連接酶連接酶切產物，過夜后轉入感受態細胞E.coliDH5a中進行擴增，挑取克隆提質粒行雙酶切鑒定并選擇純化pEGFP-N1-IL-17重組質粒，在北京華基因生物工程公司進行測序。

1.6 重組質粒pEGFP-N1-IL-17轉染喉癌Hep-2細胞把培養瓶中的喉癌Hep-2細胞用不含EDTA的胰酶消化，消化后把相同數量的細胞接種到6孔板中，鋪勻，使其在轉染日的細胞密度能達到90%，6孔板中的每個孔中加入2 ml培養液(DMEM配的培養基用于Hep-2細胞)，在37 ℃細胞培養箱中培養6孔板。細胞長到貼壁狀態以后，棄培養液，PBS洗2次。每孔加入1 500 μl Opti-MEM (注意用無酶槍頭)。加藥時注意用無酶槍頭、避光，設置6孔板的3個孔分別為空白對照組、陰性對照組和實驗組。先將空白對照組、陰性對照組和實驗組的3個孔的藥加好：取6個無酶EP管，分成3組：空白對照組、陰性對照組和實驗組。空白對照組的2個無酶EP管每管加入250 μl Opti-MEM，再在其中一管中加入Lipofectamine 2000 5 μl，混勻，另一管不加；陰性對照組的2個無酶EP管，一管加Lipofectamine 2000 5 μl混勻，另一管加10 μl pEGFP-N1-NC，混勻；實驗組的2管其中一管加5 μl Lipofectamine 2000充分混勻，另一管加10 μl pEGFP-N1-17，充分混勻，避光靜置5 min后將每組的兩管藥混勻，再避光20 min，然后將這3組藥分別加入空白對照組、陰性對照組、實驗組的板孔中(已經用PBS洗2次，每孔加入1 500 μl Opti-MEM的6孔板中)。在各組的藥加好之后，把6孔板置于37 ℃細胞培養箱中培養6 h，到時間后用PBS洗2次，再換上細胞培養基(DMEM +10%胎牛血清用于Hep-2細胞)，每孔加2 ml，培養24 h。

1.7 Western blot法檢測重組質粒pEGFP-N1-IL-17轉染喉癌Hep-2細胞后IL-17的表達用Western blot法分別檢測空白對照組、陰性對照組、實驗組中IL-17的表達情況。制備Hep-2細胞懸液，以相同的數量接種到6孔板中，培養6 h，棄去培養基，清洗細胞，空白對照組中加入培養基，陰性對照組加入pEGFP-N1-NC，實驗組加入pEGFP-N1-IL-17處理6 h，棄去培養液，用PBS洗2次，再換上細胞培養基，每孔加2 ml，培養24 h。棄去培養液，4 ℃預冷，PBS清洗細胞，培養板中加入蛋白裂解液(含PMSF及磷酸化酶抑制劑)充分裂解細胞，13 000 r/min，4 ℃，離心20 min，吸取上清液；BCA試劑盒檢測蛋白濃度后分裝保存。加入5×loading buffer(比例為4 ∶1)和相應體積的總蛋白樣品，在干浴鍋中煮蛋白液使其變性，保存在-20 ℃冰箱中。每個泳道加20 μg蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳；分離凝膠中的蛋白要轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶孵育PVDF膜2 h。TBST洗滌，洗滌3次，每次10 min。抗IL-17抗體孵育過夜。再用TBST洗滌3次，每次10 min。二抗孵育膜1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL化學發光底物顯影檢測蛋白。最后用Image-Pro plus 圖像處理系統分析并計算Western blot灰度值。

1.8 Western blot法檢測重組質粒pEGFP-N1-IL-17對喉癌Hep-2細胞中Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表達的影響用Western blot法分別檢測空白對照組、陰性對照組、實驗組中的Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白的表達情況。制備Hep-2細胞懸液，以相同的數量接種到6孔板中，培養6 h。棄去培養基，清洗細胞，空白對照組加入培養基，陰性對照組加入pEGFP-N1-NC，實驗組加入陽性pEGFP-N1-IL-17處理6 h后用PBS洗2 次，再換上細胞培養基，每孔加2 ml，培養24 h，棄去培養基，PBS清洗細胞，在培養板中加入蛋白裂解液裂解細胞，13 200 r/min、4 ℃離心20 min，提取上清液分裝保存。加入5×loading buffer(比例為4 ∶1)和相應體積的總蛋白樣品，在干浴鍋中煮蛋白液使其變性，保存在-20 ℃ 冰箱中。每個泳道加20 μg蛋白電泳；轉移蛋白到PVDF膜上。5%脫脂牛奶孵育PVDF膜2 h。TBST洗滌3次，每次10 min。用Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8、β-actin 抗體孵育過夜。再用TBST洗滌3次，每次10 min，再用TBST洗滌3次，每次10 min。二抗孵育膜1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，顯影，分析 Western blot 灰度值。

1.9 流式細胞儀檢測重組質粒pEGFP-N1-IL-17對喉癌Hep-2細胞凋亡的影響將喉癌Hep-2細胞消化，接種到6孔板中相同的量(每孔細胞計數為1×106)，等細胞長至貼壁狀態以后，倒掉培養液，PBS洗2次，空白對照組加入培養基，陰性對照組加入pEGFP-N1-IL-NC，實驗組加入pEGFP-N1-IL-17處理6 h后用PBS洗2次，再換上細胞培養基，每孔加2 ml，培養24 h，用不含EDTA的胰酶消化細胞，用15 ml離心管收集，300 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，400 μl PBS洗滌2次，用PE-7AAD染料對Annexin V-FITC/PI染色。用流式細胞儀檢測，最后分析實驗結果。

2 結果

2.1 qRT-PCR、Western blot法檢測重組質粒IL-17表達情況將雙酶切和測序結果均正確的質粒轉染后的Hep-2細胞，轉染重組質粒IL-17的喉癌Hep-2細胞作為實驗組，轉染pEGFP-N1-NC空載體的喉癌Hep-2細胞作為對照組，48 h后收集細胞并分為2份：1份提取RNA，通過qRT-PCR在mRNA水平檢測細胞IL-17表達水平；另一份提取蛋白，通過Western blot在蛋白水平檢測細胞IL-17表達水平。結果均表明重組質粒IL-17在喉癌Hep-2細胞能夠成功表達，見圖1。

圖1 qRT-PCR、Western blot法檢測重組質粒 IL-17轉染喉癌Hep-2細胞后IL-17的表達情況

A： qRT-PCR檢測結果；B：Western blot法檢測結果；Control：空白對照組；Scramble：陰性對照組；pEGFP-N1-IL-17：實驗組；與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 重組質粒pEGFP-N1-IL-17對喉癌Hep-2細胞中Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表達的影響與空白對照組相比，陰性對照組細胞內的Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白的表達無明顯變化(F=58.170，P=0.218)。與空白對照組比較，實驗組4種蛋白明顯降低，差異有統計學意義(F=72.15，P<0.01)。見圖2。

圖2 Western blot 法檢測重組質粒 pEGFP-N1-IL-17轉染喉癌Hep-2細胞中Fas、FasL、 Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表達的變化

與空白對照組(Control)比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 重組質粒(pEGFP-N1-IL-17)對Hep-2細胞凋亡的影響空白組凋亡率為(11.4±1.52)%，陰性對照組凋亡率為(12.64±7.28)%，實驗組凋亡率為(3.39±5.37)%，實驗組與空白對照組和陰性對照組比較，實驗組的凋亡率明顯降低(F=58.48，P<0.01)。見圖3。

3 討論

喉癌是以鱗狀細胞癌為主的頭頸部常見的惡性腫瘤[1]。對喉癌患者來說，非手術療法可以保留喉的正常解剖結構和喉的生理功能，這種治療方法對喉癌患者具有很大的意義[2]。IL-17是CD4+T Th17 等細胞分泌的一種細胞因子[3]。IL-17的相關研究主要集中在腫瘤疾病方面[4]。還有研究[5]顯示Lewis肺癌荷瘤小鼠的MDSCs細胞的凋亡也是可以被IL-17抑制的。細胞凋亡是由多基因調控的，主要有兩條途徑來調控：一是細胞膜上的受體途徑，二是細胞內的線粒體途徑[10]。細胞膜上的受體途徑中Fas與Fasl結合可觸發凋亡，細胞凋亡有一條主要途徑是由Fas、FasL介導的，此通路的某些環節缺失可能與腫瘤細胞的無限增殖有關。Fas作為一種細胞表面受體，與其配體FasL結合后，使細胞表面形成胞內銜接子三聚體，導致 caspase1、3、6、7形成級聯反應誘導細胞的凋亡[11]。本實驗Western blot研究結果表明：用pEGFP-N1-IL-17轉染24 h后的喉癌Hep-2細胞內 Fas、FasL、Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。同時Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測的結果表明：與空白對照組比較，用pEGFP-N1-IL-17轉染24 h后的喉癌Hep-2細胞的凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

本研究結果表明，重組質粒pEGFP-N1-IL-17轉染后的喉癌Hep-2細胞Fas及其配體FasL明顯下調，同時Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase8表達也明顯下調，提示重組質粒pEGFP-N1-IL-17可能通過下調 Fas和FasL蛋白表達，抑制caspase 8后阻斷caspase3的活化，從而抑制喉癌細胞Hep-2凋亡。所以IL-17可能通過Fas/FasL信號通路來抑制喉癌Hep-2細胞凋亡，為研究喉癌的機制和治療喉癌提供了依據。除Fas/Fasl介導的死亡受體途徑，IL-17是否可以通過其他途徑抑制喉癌Hep-2細胞凋亡仍需探索。

圖3 流式細胞術檢測重組質粒(pEGFP-N1-IL-17)對Hep-2細胞凋亡的影響A：空白組；B：pEGFP-N1-NC組；C：pEGFP-N1-IL-17組