ARL2在宮頸癌組織中的表達及對宮頸癌細胞表型的影響

彭瑞清，王 楊，孫 穎，王 凊，胡志東

宮頸癌是婦科常見的腫瘤之一，是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，據國際癌癥中心統計，全球每年新發宮頸癌人數約49.3萬，死亡27.4萬，其中85%以上發生在低收入和中等收入國家[1]。2015年中國子宮頸癌新發病例約9.89萬例，死亡病例約3.05萬例[2]。目前對于宮頸癌的治療多采用手術、放療及輔助化療等方法，5年生存率始終在50%左右。因此，進一步尋找宮頸癌早期的分子標志物及潛在的治療分子靶點成為臨床的熱點。

本實驗前期發現ADP-核糖基化樣因子2(ADP ribosylation factor like protein 2，ARL2)在宮頸癌組織中表達水平明顯升高。ARL2是一種單體的GTP結合蛋白，為ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)亞家族成員之一[3]。ARL家族廣泛的存在于各種真核生物中，但其結構和功能高度保守，在生物體中有著重要的病理生理功能[4]。在腫瘤領域，ARL2扮演著癌基因或抑癌基因的角色，成為治療的靶點。做為ARL家族中比較有代表性的成員，ARL2的研究雖然有了一些成果，但ARL2在宮頸癌中的研究卻少見報道。現采用RNA 干擾ARL2 的表達，探討其對宮頸癌細胞的生長、侵襲以及遷移能力的調節作用，以期為闡明宮頸癌發生和轉移的機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1細胞和組織 HeLa細胞和C33A細胞購自天津賽爾生物技術有限公司；含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640，置于細胞培養箱中培養(培養條件：37 ℃，5%CO2)。15對經病理學檢查確診的人宮頸癌組織及其對應正常宮頸組織標本為天津醫科大學總醫院中心實驗室保存。

1.1.2試劑 RPMI 1640細胞培養液、胰蛋白酶和胎牛血清(美國GIBCO公司)、脂質體lipofectamine 2000、兔源抗-GAPDH抗體、無血清培養基Opti-MEM(德國SIGMA-ALDRICH公司)，兔源抗-ARL2抗體、HRP標記羊抗兔IgG抗體(北京OFT公司)，SuperRX感光膠片(FUMINGWEI公司)。

1.2 方法

1.2.1質粒轉染 采用Lipofectamine 2000脂質體轉染法，分成兩組進行實驗：對照質粒siR-Ctrl(pSilencer 2.1)轉染、干擾質粒siR-ARL2(pSilencer/ARL2-shRNA)轉染。轉染前1 d 1×106/ml傳代HeLa細胞、2×106/ml傳代C33A細胞，待細胞生長至60%～80%時，以轉染細胞。

1.2.2實時熒光定量PCR技術檢測ARL2 mRNA的表達 采用TRIzol試劑(日本TaKaRa公司產品)從15對宮頸癌組織和正常組織標本中提取總RNA，所有操作按說明書在去RNA酶的條件下進行，分光光度法測定RNA濃度；采用M-MLV逆轉錄酶(Promega, Madison, WI) 逆轉錄合成cDNA。以β-actin基因作為內參照，按照說明書于Bio-Rad Real-time PCR 儀上檢測ARL2 mRNA的表達水平；分別用不同引物進行實時定量PCR反應，所用引物全由北京賽維生物技術有限公司化學合成。實時熒光PCR反應的循環參數為：① 預變性，94 ℃、3 min，② 變性，94 ℃、30 s，③ 退火，56 ℃、30 s，④ 延伸，72 ℃、30 s，②～④步共40個循環。采用2-ΔΔCt方法計算ARL2與內參基因β-actin的表達水平。

1.2.3Western blot法檢測ARL2、GAPDH蛋白表達 轉染培養48 h后，裂解細胞，制備蛋白樣品。總蛋白經過電泳分離，半濕電轉移形成印跡后，先后將膜置于含對應一抗和二抗的5%脫脂奶粉中封閉2 h和避光緩速搖動作用1.5 h。漂洗3次，ECL顯色，ARL2蛋白的相對含量采用ARL2目的蛋白與GAPDH內參蛋白積分光密度的比值進行表示。

1.2.4免疫組化方法檢測ARL2蛋白的表達 5組宮頸癌組織和癌旁正常組織標本經甲醛固定、石蠟包埋處理后制成厚度為4 μm的切片；脫蠟，梯度乙醇水化并用PBS沖洗，抗原修復后再次采用PBS沖洗切片，DAB顯色，蘇木精復染后梯度乙醇脫水，透明后用中性樹膠封片。結果判定：切片隨機編號，雙盲閱片。光學顯微鏡觀察，陽性著色呈棕黃色，根據不同抗原的細胞定位，其棕黃色位于細胞不同的位置。

1.2.5MTT檢測細胞生長活性 以每孔6 000個(C33A細胞每孔11 000個)將轉染36 h的HeLa細胞接種至96孔板，每組5孔，共3個孔板。每24 h隨機選擇一組，利用MTT法，在570 nm波長處測各接種孔的吸光度值(A570)。

1.2.6集落形成能力檢測 轉染后48 h，將HeLa細胞以每孔150個(C33A以每孔300個)接種在12孔板上，每組接種3個復孔。孵箱中培養10～12 d，集落形成標準：細胞數≥50個，培養結束條件：集落之間發生互相融合，甲醇固定細胞，室溫染色，沖洗后觀察。

1.2.7體外侵襲檢測 選用孔徑為8 μm的24孔Transwell小室，Matrigel凝膠用無血清PRMI 1640稀釋成為2 mg/ml，包被Transwell小室的上室部，在濾膜上表面加入40 μl，培養形成膠狀。取5×104個轉染后的HeLa細胞(1.5×105個轉染后的C33A細胞)置于1.5 ml EP管中，2 000 r/min離心5 min，并以200 μl RPMI 1640培養液重懸細胞后加入Transwell小室中的上室，并將600 μl的胎牛血清培養液加入到下室。37 ℃、5%CO2條件下培養24 h，將未穿過濾膜的腫瘤細胞去除，甲醇中固定1 min，染色后揭下濾膜，采用封片劑將其封于載玻片上，使用顯微鏡統計穿過小室底膜的細胞數量，方法如下：每室隨機選取5個視野并拍照計數穿過小室底膜的細胞，計算得出平均值。重復實驗3次。

1.2.8劃痕實驗 選取24孔板，每個孔內接種HeLa細胞數約為6×104個，轉染后培養24 h，用移液槍頭貼著直尺，垂直于板底呈一字型劃痕，分別在劃痕后的0、24、48 h顯微鏡下測量劃痕的寬度。重復實驗3次。

2 結果

2.1 ARL2在人體宮頸癌組織和癌旁組織中的差異性表達實時定量PCR結果顯示，在15對宮頸癌組織中，ARL2表達水平與癌旁正常組織比較升高了3.2倍(P<0.05)，見圖1。

圖1 ARL2 mRNA在15對宮頸癌和癌旁組織中的差異性表達與癌旁正常組織比較：*P<0.05

2.2 免疫組化方法檢測結果ARL2在5組宮頸癌組織中表達陽性(陽性率為83.3%)，癌旁正常組織中均為陰性，表明ARL2在宮頸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，見圖2。

2.3 Western blot法檢測ARL2蛋白的表達由圖3可以看出，與轉染siR-Ctrl組比較，RNA干擾48 h后siR-ARL2組有較明顯的降低，siR-ARL2組中蛋白表達水平在HeLa細胞中下降了約59%[(1.00±0.07)vs(0.41±0.06)]，在C33A細胞中下降了60%[(1.00±0.11)vs(0.40±0.05)]，差異有統計學意義(t=5.6、5.3，P<0.05)。提示RNA干擾ARL2后，其在宮頸癌細胞中表達明顯下降，證明干擾質粒是能有效抑制宮頸癌細胞中ARL2基因的表達的。

圖2 ARL2在宮頸癌組織和癌旁 組織中的表達差異 DAB染色×100 A：宮頸癌組織；B：癌旁組織

圖3 Western blot法檢測siR-ARL2質粒的有效性

A：瞬轉siR-ARL2質粒及其對照后ARL2蛋白表達水平代表圖；B：定量分析圖；與siR-Ctrl組比較：*P<0.05

2.4 RNA干擾后細胞生長活性的變化從MTT實驗結果可以看出，與對照組比較，轉入siR-ARL2及其對照后，細胞的生長活性有明顯的減弱，如圖4所示，HeLa細胞下降了約28%[(1.00±0.05)vs(0.72±0.04)]，C33A細胞中下降了約22%[(1.00±0.06)vs(0.78±0.04)]，差異有統計學意義(t=2.6、2.3，P<0.05)。提示RNA干擾ARL2基因后減弱了宮頸癌細胞的生長活性。

2.5 RNA干擾后宮頸癌細胞集落形成能力的變化在HeLa細胞和C33A細胞中轉染siR-ARL2及siR-Ctrl后分別進行集落形成實驗，如圖5所示，與轉染siR-Ctrl的對照組比較，轉染siR-ARL2組的細胞集落形成率明顯下降，HeLa細胞下降了約36%[(66.00±0.73)vs(42.33±0.21)，t=4.7，P<0.05]，C33A細胞中下降了約60%[(35.60±0.39)vs(14.30±0.31)，t=6.2，P<0.05]，說明siR-ARL2抑制宮頸癌細胞的集落形成能力。

圖4 MTT實驗分析siR-ARL2對宮頸癌生長活性的影響與siR-Ctrl組比較：*P<0.05

圖5 集落形成實驗分析siR-ARL2對宮頸癌集落形成的影響

A：各組細胞集落形成結晶紫染色代表圖；B：結晶紫染色后集落計數的定量分析；與siR-Ctrl組比較：*P<0.05

圖6 Transwell侵襲實驗檢測siR-ARL2對宮頸癌細胞侵襲能力的影響A：顯微鏡下侵襲實驗每組的代表圖×400；B：顯微鏡下每個視野平均侵襲細胞數的定量分析；與siR-Ctrl組比較：*P<0.05

圖7 HeLa細胞在轉染不同的質粒下遷移的距離圖A：顯微鏡下細胞劃痕實驗每組不同時間的代表圖；B：劃痕寬度的相對定量分析；與siR-Ctrl組比較：*P<0.05

2.6 干擾ARL2后宮頸癌細胞侵襲能力分析分別在HeLa細胞和C33A細胞中轉染siR-Ctrl及siR-ARL2后進行Transwell侵襲實驗，結果與對照組比較，實驗組中宮頸癌細胞的侵襲能力受到了非常大的抑制，HeLa細胞下降了約49%[(113.00±3.83)vs(58.00±2.41)，t=5.2,P<0.05]，C33A細胞中下降了約54%[(89.00±4.50)vs(41.00±1.92)，t=5.7，P<0.05]，說明siR-ARL2能夠抑制宮頸癌的侵襲。見圖6。

2.7 siR-ARL2后宮頸癌細胞遷移能力的變化RNA干擾后的細胞劃痕實驗顯示，HeLa細胞轉染干擾質粒細胞劃痕后24 h及48 h遷移的距離明顯大于轉染對照組遷移的距離(F=19.75，P<0.05)。提示RNA干擾ARL2后HeLa細胞的遷移能力降低。見圖7。

3 討論

宮頸癌居婦科惡性腫瘤病死率前列，盡管早期宮頸癌預后較好，但是仍有許多患者死于宮頸癌的轉移和復發[5]。全世界每年約有500 000新發宮頸癌病例，超過1/3的患者死亡[6]。近年來，盡管宮頸癌手術治療的效果逐漸得到改善，但癌細胞的侵襲和轉移嚴重影響了相關治療的效果，在分子水平上尋找腫瘤靶向治療已逐漸被臨床實踐所認識。

ARL2是一種GTP酶，它能快速結合GTP或GDP分子，不依賴于脂類[7]，當與GTP或GDP結合時，ARL2在不同條件扮演不同的角色。ARL2以ARL2-GDP 的形式結合微管蛋白輔助因子D(tubulincofactor D，TBCD)并調節微管動力學[8]。ARL2-GTP與ARL2結合因子(BART)形成線粒體復合體[9]，維持線粒體形態、運動、ATP水平和線粒體融合。

Long et al[10]通過熒光素酶報告證實在結腸癌中，miR-214通過與ARL2 3′UTRs結合調控ARL2表達，Western blot和qRT-PCR也證實miR-214抑制ARL2的蛋白和mRNA表達，與ARL2 siRNA作用相似，這些結果表明miR-214通過ARL2的3′UTRs直接負調控ARL2，抑制結腸癌細胞的生長和轉移，進而促進癌細胞死亡。在胰腺癌細胞中，ARL2-GTP通過誘導肌動蛋白-細胞骨架重排從而抑制Ras同源物基因家族成員A(Ras homolog family member A，RhoA)的活性，促進胰腺癌細胞侵襲。而BART可與ARL2-GTP結合，抑制ARL2的功能，減少肌動蛋白細胞骨架的重排，增加胰腺癌細胞中活性RhoA的含量，進而抑制腫瘤細胞的侵襲性[11]。在乳腺癌細胞中，高表達ARL2 的乳腺癌細胞中蛋白磷酸酶PP2A催化亞單位(PP2Ac)含量顯著增加，低表達ARL2乳腺癌細胞中PP2Ac含量顯著降低，與對照組比較，兩組細胞中PP2Ac基因水平無顯著性差異[12]。本文通過siRNA誘導的RNA干擾顯著抑制了ARL2基因的表達，降低了宮頸癌細胞的生長、侵襲以及遷移能力，逆轉了宮頸癌細胞的惡性表型，盡管其內在的具體分子機制尚不明確，但是為宮頸癌的基因診斷以及后期的基因治療提供了新的思路和方法。