鼠源GFP-VNN1重組質粒的構建及其功能研究

李 琳，李 俊

重組人血管非炎性因子1基因(Vanin-1，VNN1)是一種位于細胞膜上的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)-錨定蛋白，具有泛酰巰基乙胺酶活性，表達于人類及小鼠的多種組織中，其中腎臟、胸腺和脾等免疫組織具有較高的mRNA表達量[1]。多項研究[2-4]顯示VNN1可以通過調控氧化應激反應標志物活性氧簇(ROS)、抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)、cysteamine及抗氧化蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)等分子或蛋白參與氧化應激反應，提示以VNN1基因為靶點的治療未來有可能逆轉氧化應激及炎癥相關性疾病的進展。本實驗擬通過體外構建能夠穩定表達VNN1蛋白的重組質粒，并觀察其轉染RAW264.7細胞后對細胞因子分泌及細胞凋亡的影響，為深入探討其參與免疫相關性疾病的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要實驗材料RAW264.7細胞系、綠色熒光蛋白(GFP)及DH5α感受態細胞由安徽省天然藥物活性研究重點實驗室保存。總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；高糖DMEM液體培養基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；凝膠純化試劑盒、限制性內切酶、T4 DNA marker、DNA 連接酶(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司)；流式試劑盒(上海貝博公司)；小鼠酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技公司)；ECL顯色試劑盒(美國Pierce公司)；BCA法蛋白濃度定量試劑盒(武漢生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)單克隆抗體(美國Abcam公司)；山羊抗兔IgG二抗、兔抗小鼠二抗(北京中杉金橋公司)。

1.2 實驗儀器流式細胞儀、CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；細菌培養箱 (德國Heraeus公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳儀、酶標儀(美國Bio-Red公司)；高速低溫離心機(美國Sigma公司)；紫外凝膠成像系統(南京捷達生物技術公司)；PCR梯度擴增儀(德國Eppendoff公司)。

1.3 鼠源GFP-VNN1重組質粒構建從NCBI GenBank 數據庫查找VNN1的DNA序列，根據引物設計原則用Primer 5.0軟件設計PCR引物。上游引物:5′-AAGCTTCCGCTGCACCATGACTACTC-3′(下劃線為HindⅢ酶切位點)，下游引物：5′-GGATCCGCTCGAGCTACCAACTTAATGA-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)。PCR反應條件為95 ℃、3 min；94 ℃、40 s；58 ℃、40 s；68 ℃、110 s；循環35次后72 ℃延伸10 min。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳分離純化。純化后產物經雙酶切法與GFP載體連接，連接產物轉化搖菌，挑選陽性克隆，酶切法鑒定后，送至上海Invitrogen生物技術有限公司測序，序列比對正確后進行后續實驗。

1.4 RAW264.7細胞培養RAW264.7細胞用含10% FBS的DMEM培養基置于37 ℃、5%CO2培養箱培養，培養基應加入青霉素和鏈霉素各100 U/ml。每天更換新鮮培養基，取處于對數期生長的細胞用于實驗。

1.5 GFP-VNN1重組質粒轉染RAW264.7細胞轉染前24 h用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)消化細胞，接種2 ml密度為1.5×105/ml的待轉染細胞于6孔板中，培養條件為37 ℃、5%CO2，待細胞貼壁生長后準備轉染。分別將6 μl質粒和8 μl脂質體溶于150 μl OPTI-MEM培養基中，靜置5 min后將兩者混合均勻，室溫靜置15 min。棄去6孔板中舊DMEM培養基，PBS漂洗2次后加入1.7 ml OPTI-MEM，再逐滴加入質粒-脂質體混合物，混合均勻后置37 ℃、5%CO2培養6 h，然后更換含10% FBS 的DMEM完全培養基繼續培養。

1.6 Western blot法檢測細胞中VNN1、TNF-α和IL-6蛋白表達轉染48 h后，裂解各組細胞得到總蛋白樣品，加入2×SDS上樣緩沖液于100 ℃煮沸5 min。BCA法測定蛋白濃度，與標準蛋白Marker一起進行8% SDS-PAGE凝膠電泳，用濕轉法將蛋白轉到PVDF膜上，TBST洗膜3次后，分別用VNN1、TNF-α、IL-6 的一抗于4 ℃過夜孵育。TBST洗膜后，加入VNN1、TNF-α、IL-6 的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL試劑盒顯色，電腦顯影成像，Image J 圖像分析軟件對各條帶進行分析，實驗重復3次。

1.7 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6表達轉染48 h后，取出6孔板中各組細胞上清液，離心，按照ELISA試劑盒的操作步驟進行操作，加樣、加酶、顯色、終止等。使用酶標儀測量各孔吸光度，最后繪制標準曲線計算樣本濃度。實驗重復3次。

1.8 流式細胞術檢測RAW264.7細胞凋亡情況轉染48 h后，收集6孔板中各組細胞，按試劑盒說明書操作：每組用400 μl Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μl Annexin V染液，避光孵育15 min，然后加入10 μl PI，避光孵育5 min，1 h內在流式儀上檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次。

2 結果

2.1 GFP-VNN1重組質粒的構建及鑒定提取的GFP-VNN1質粒用HindⅢ和 BamHⅠ限制性內切酶雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離得到約1 542、4 735 bp兩條帶，與VNN1片段的大小和載體GFP的大小相符，表明VNN1已被插入到GFP 載體中。酶切結果見圖1。VNN1基因測序結果與GenBank上的序列一致，表明GFP-VNN1表達載體構建正確，可用于后續實驗。

圖1 GFP-VNN1重組質粒經雙酶切鑒定電泳圖

M：DNA Marker；1：HindⅢ和BamHⅠ雙酶切GFP-VNN1重組質粒

2.2 VNN1蛋白在RAW264.7細胞中的表達經Western blot法檢測顯示正常組、空質粒轉染組以及GFP-VNN1重組質粒轉染組細胞內均有VNN1蛋白表達。GFP-VNN1重組質粒轉染組VNN1蛋白的表達明顯高于其他兩組細胞，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.01,F=3.063)，見圖2，表明GFP-VNN1重組質粒能在RAW264.7細胞穩定高表達VNN1蛋白。

圖2 Western blot法檢測RAW264.7細胞中VNN1蛋白的表達

N：正常組；NC：空質粒轉染組；VNN1：GFP-VNN1重組質粒轉染組；與正常組比較：**P<0.01

2.3 GFP-VNN1重組質粒對細胞因子TNF-α和IL-6分泌的影響ELISA結果顯示，GFP-VNN1重組質粒能顯著升高RAW264.7中TNF-α和IL-6的表達(P<0.05，F=0.082；P<0.05，F=0.592)，與正常組比較差異有統計學意義；Western blot法檢測RAW264.7細胞中TNF-α和IL-6蛋白表達升高(P<0.05，F=1.538；P<0.05，F=1.509)，與正常組比較差異有統計學意義。結果見圖3、4，提示GFP-VNN1重組質粒能促進細胞因子TNF-α和IL-6分泌。

2.4 GFP-VNN1重組質粒對RAW264.7細胞凋亡的影響與正常組比較，GFP-VNN1重組質粒轉染組凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05,F=0.076)。說明重組質粒GFP-VNN1能促進RAW264.7細胞發生凋亡。見圖5。

3 討論

泛酰巰基乙胺酶(Vanin,VNN)是近幾年生物學研究的熱點，是一種泛酰巰基乙胺的水解酶，能水解泛酰巰基乙胺形成泛酸和半胱胺。Vanin基因的亞型包括VNN1、VVN2和VNN3，小鼠體內有VNN1和VNN3兩種亞型，位于10 號染色體的10A2B1; 人體內有VNN1、VVN2 和VNN3三種亞型，位于6號染色體的q22～24，人類和小鼠的Vanin 基因的總氨基酸具有高度一致性[5-7]。

圖3 ELISA法檢測GFP-VNN1重組質粒對 細胞因子TNF-α和IL-6分泌的影響

A：TNF-α；B：IL-6；N：正常組；NC：空質粒轉染組；VNN1：GFP-VNN1重組質粒轉染組；與正常組比較：*P<0.05

圖4 Western blot法檢測GFP-VNN1重組質粒對 細胞因子TNF-α和IL-6分泌的影響

N：正常組；NC：空質粒轉染組；VNN1：GFP-VNN1重組質粒轉染組；與正常組比較：*P<0.05

圖5 流式細胞術檢測GFP-VNN1重組質粒對RAW264.7細胞凋亡的影響

A： 3組流式細胞圖比較; B: 3組細胞凋亡率比較；N：正常組；NC：空質粒轉染組； VNN1：GFP-VNN1重組質粒轉染組；與正常組比較：*P<0.05

VNN1是Vanin家族中研究最多的一個亞型，其對氧化應激反應的調控引起了越來越多科研人員的關注。研究[8]顯示VNN1與NF-κB通路的激活成正相關，干擾VNN1基因后，不僅抑制了LPS對NF-κB的激活，還抑制了NF-κB的核轉位，進而抑制了氧化應激和炎癥的發生；同時應用NF-κB抑制劑BAY11-7082也能部分削弱VNN1介導的氧化應激反應。干擾VNN1表達的細胞株中即使給予白介素-1β(IL-1β)這一高效的促炎刺激因素，也未能引起炎癥因子表達水平的增加，提示在炎癥反應中VNN1是一個關鍵的作用因子[9]。研究[10]顯示在小鼠糖尿病模型中，體內或體外實驗中敲除VNN1基因后，胰島細胞凋亡減弱，有學者推測VNN1基因可能通過調控組織釋放cystamine對胰島細胞產生保護作用。以上研究結果提示VNN1基因的表達與多項炎癥相關性疾病的病程進展有很強的關聯性。

在生物醫學研究中GFP因其在相應波長的紫外光激發下發出綠色熒光故常作為標記蛋白，用以實時觀察目標蛋白在細胞中的移動和定位，或用以檢測基因轉錄效率，目的蛋白的表達量等[11-12]。GFP作為使用最為廣泛的標記蛋白之一，由于其分子量小，可以與其他目的基因形成融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發活性，同時不影響目的基因的生物活性[13]。

本實驗通過基因重組技術成功建立了過表達VNN1的GFP-VNN1載體，并且進一步研究發現過表達VNN1能促進RAW264.7細胞炎性因子TNF-α、IL-6分泌和細胞的凋亡。本研究還發現與正常組比較，空質粒轉染組VNN1、TNF-α、IL-6的表達均有輕微升高，這種現象可能是由于轉染試劑中的Lipofectamine 2000所致。Lipofectamine 2000對細胞具有一定的毒性，可以激活RAW264.7細胞，分泌炎癥因子如TNF-α和IL-6，導致空質粒轉染組TNF-α和IL-6分泌增加。而TNF-α和IL-6為體內重要的炎癥因子，能與相應的受體結合，激活相應的炎癥反應，導致空質粒轉染組VNN1的表達升高。本研究結果提示VNN1的高表達可能會加劇炎癥相關性疾病的發展，而干擾VNN1表達則可能對疾病緩解有重要意義。本研究結果為深入研究VNN1基因的分子機制奠定了基礎，并為研究其生物學活性和在免疫相關性疾病中的作用提供了新思路。以VNN1基因為靶點的治療將可能逆轉炎癥等相關疾病的發展，但這需要通過大量的實驗室研究和臨床試驗證實。