人黑色素瘤抗原A3在宮頸癌組織和細胞中的表達研究

石若冰，王 琰，何海鵬，李 青，馬 英，梁義娟，劉 金，齊 冀，高新萍

宮頸癌(cervical cancer, CC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內，宮頸癌CC的發病率居女性惡性腫瘤的第三位[1-2]。黑色素瘤抗原(melanoma antigen gene，MAGE)屬于癌睪抗原(cancer testis gene, CTA)，在正常組織中CTA 僅表達于睪丸和胎盤中，而在各種腫瘤組織中呈高表達[3-5]，其中MAGE-A3 為MAGE-A 家族重要成員，是目前已知的免疫原性最強、能被免疫細胞識別的肽表位最多的抗原。因此MAGE-A3在CC的發生、發展中所起的作用日益受到學者的關注。該研究應用免疫組織化學SP法、Western blot和RT-qPCR法分別檢測了MAGE-A3在宮頸組織和CC細胞株中的表達情況，初步探討了MAGE-A3在CC中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1細胞培養 CC細胞株HeLa、SiHa和C-33A購自北京市中國醫學科學院，用含10%胎牛血清的DMEM培養基在含5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養箱中培養。作為正常對照的細胞株End1/E6E7(購自美國模式菌種收集中心)，用含0.05 mg/ml牛垂體提取物(bovine pituitary extract, BPE)和0.1 ng/ml人重組表皮生長因子(human recombinant epidermal growth factor, EGF)的角化細胞無血清培養基(keratinocyte-serum free medium, K-SFM)培養，其他培養條件同前。

1.1.2組織標本 60例組織標本取自河北大學附屬醫院婦產科2015年1月～2017年1月間首診并行婦科手術患者的宮頸組織。收集存檔蠟塊標本，其中正常宮頸組織20例(標本均來源于本院因子宮肌瘤等良性病變行子宮全切術后的宮頸切片標本)，CC組織40例(所有患者術前均未進行腫瘤的放療及化療)。所有病例均需經病理診斷證實，所有患者均排除患其他惡性腫瘤疾病或急慢性疾病。實驗方案經醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1免疫組化法 將石蠟切片常規脫蠟和水化后,0.01%枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復，滴加適量3%雙氧水，以消除內源性過氧化物酶活性，滴1滴正常山羊血清封閉液(試劑A)，室溫下孵育15 min，每張切片加適當稀釋后的MAGE-A3一抗工作液約50 μl；空白對照組加PBS液約50 μl，置于4 ℃冰箱過夜孵育。滴加稀釋后的二抗50 μl(試劑B)，滴加過氧化物酶標記鏈霉卵白素(試劑C)，最后滴加DAB 溶液顯色，光鏡下觀察切片。以胎盤組織做陽性對照。顯微鏡下觀察，于細胞中見棕黃色顆粒的為MAGE-A3陽性細胞。

1.2.2RT-qPCR 收獲對數生長期的細胞，用TRIzol試劑盒提取RNA,經紫外分光光度儀進行RNA濃度和純度的測定，逆轉錄合成cDNA，RT-qRCR反應條件為45 ℃、50 min。利用Pubmed查找基因的序列號，上海生科公司利用基因序列號合成相關基因的實時定量PCR引物，MAGE-A3上游引物序列：5′-GGGACGGACATCTTCACTGG-3′； MAGE-A3下游引物序列：5′-CCACCAATTCTTGTGGCACC-3′；內參GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCT-3′；內參GAPDH下游引物序列：5′-AGGTCCACCACTACACGTTT-3′。將反應體系置于PCR擴增儀上94 ℃預變性3 min，然后開始PCR循環：94 ℃、15 s，65 ℃ 、30 s，72 ℃、30 s，共40個循環，最后1個循環72 ℃延長10 min。所取數據根據2-ΔΔCt公式計算mRNA相對表達量。

1.2.3Western blot 收獲對數生長期的細胞后，裂解細胞提取總蛋白并進行蛋白定量(采用BCA法蛋白定量)，配制10% SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量30 μl，經電泳、轉膜、封閉，與MAGE-A3抗體(稀釋度1 ∶2 000)4 ℃搖床慢慢搖晃過夜孵育，洗膜后，與抗鼠二抗(稀釋度1 ∶3 000)37 ℃培養箱慢慢搖晃孵育2 h，洗膜后將顯影液加于PVDF膜上。用凝膠成像系統進行掃描并分析。以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度比值計算各組蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 免疫組織化學SP法檢測宮頸組織中MAGE-A3的表達MAGE-A3主要表達于細胞質中，呈淺黃色至棕褐色。其在正常宮頸組織和CC組織中陽性表達率分別為0%(0/20)和70%(28/40)。在20例正常宮頸組織中MAGE-A3均呈陰性表達，在40例CC組織中28例呈陽性表達，12例呈陰性表達。CC組表達高于正常宮頸組，差異有統計學意義(χ2=26.25，P<0.05)。見圖1。

2.2 RT-PCR檢測宮頸細胞中MAGE-A3 mRNA的表達檢測基因MAGE-A3的mRNA水平結果顯示，CC細胞組與正常宮頸細胞組間差異有統計學意義(P<0.05)；而3種CC細胞之間差異無統計學意義。見圖2。

圖1 正常宮頸組織和宮頸癌組織中MAGE-A3的表達 SP×200 A：正常宮頸組織；B：宮頸癌組織

圖2 4種宮頸細胞中MAGE-A3 mRNA的表達比較 與正常宮頸細胞(End1/E6E7)組比較：*P<0.05

2.3 Western blot檢測宮頸細胞中MAGE-A3蛋白的表達MAGE-A3蛋白在3株CC細胞和正常宮頸細胞中的表達與mRNA相似，CC細胞組與正常宮頸細胞組間差異有統計學意義(P<0.05)，而3種CC細胞之間差異無統計學意義。見圖3。

圖3 4種宮頸細胞中MAGE-A3蛋白的表達比較 與正常宮頸細胞(End1/E6E7)組比較：*P<0.05

3 討論

MAGE-A3表達于多種惡性腫瘤，而在正常組織中不表達(除睪丸和胎盤外)，具有腫瘤特異性，是腫瘤特異性免疫治療的理想靶點[3]。研究[6-8]顯示，MAGE-A3基因在黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、喉癌[9]等多種腫瘤中有不同程度的表達。Hatiboglu et al[10]通過研究得出MAGE-A與非轉移性腎癌的預后不良有關。Han et al[11]通過對喉鱗狀細胞癌的組織研究表明，MAGE-A表達是喉鱗癌患者預后的生物標志物，MAGE-A高表達提示喉癌患者預后不良。Gu et al[9]通過對肝細胞癌的分析數據表明MAGE-A高表達是肝癌患者不利預后的生物標志物。Duan et al[12]研究表明MAGE-A3抗原在腫瘤的邊緣有表達，炎癥組織、良性腫瘤及癌旁組織中則不表達，這一特點為MAGE-A3用于腫瘤分子學診斷和免疫治療創造了條件。

本研究中，使用免疫組化法評估了CC組織中的MAGE-A3蛋白表達，結果顯示MAGE-A3在細胞質中高表達。這與Yin et al[13]在膀胱移行細胞癌的研究結果一致。提示CC組織中MAGE-A3相對表達量明顯高于正常宮頸組織。

本研究顯示，MAGE-A3基因在CC細胞株Hela、SiHa、C-33A中呈高表達，在正常宮頸細胞株End1/ E6E7細胞中表達量極低。這就說明MAGE-A3可能參與了CC的發生和發展，并在此過程中可能發揮著一定的作用。因此下一步工作將探討MAGE-A3是否在CC侵襲、轉移以及增殖中發揮作用，并深入研究其作用機制，從而為MAGE-A3是否為CC的促癌基因提供實驗依據。

Russo et al[14]利用能表達MAGE-A3的轉基因的淋巴細胞MAGE-A3-GML治療黑色素瘤患者，10例患者中3例表現出外周循環血中抗MAGE-A3 T細胞增加，并且促進皮膚關于MAGE-A3遲發型過敏反應的發生。但其中有2例患者抗MAGE-A3的T細胞不僅在血液中被檢出，在腫瘤組織中也能被檢出，表明MAGE-A3-GML的注射能誘導抗腫瘤的T細胞，這些T細胞能浸潤到腫瘤組織內部。王謙 等[15]通過MAGE-A3蛋白刺激獲得能夠呈遞其抗原的成熟樹突狀細胞，再用該細胞刺激T淋巴細胞而獲得能夠識別MAGE-A3蛋白的CD8+細胞毒T淋巴細胞，表明MAGE-A3-DC-CD8+CTL具有特異性的腫瘤殺傷能力。由此可見，MAGE-A3是腫瘤免疫治療的理想靶點。