二十二碳六烯酸改善抑郁母鼠子代的認知功能研究

梁正儀，鄧秀英

圍產期抑郁(perinatal depression, PND)是一種在孕期高發的精神類疾病，據統計，大約20%的女性在孕期被認為患有抑郁癥[1]。圍產期抑郁不僅僅會影響胎兒的發育，導致胎兒胎盤功能受損、胎兒生長下降等多種癥狀[2]；同時也會影響兒童的生長和發育，具體表現為發育延遲，出現焦慮、認知和注意力缺陷等行為和情感控制方面的問題[3]。因此，采用有效的治療方法既有利于改善母親疾病，也有助于優生優育。

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種omega-3長鏈多不飽和脂肪酸，廣泛分布于中樞神經系統，特別是突觸膜、突觸囊泡等部位。研究[4]顯示，缺乏DHA會使動物在認知和行為測試中降低學習和記憶相關能力。此外，各級神經退行性疾病也與低水平的DHA相關，但補充DHA可改善癥狀[5]。本研究擬評估處于抑郁狀態下孕鼠的子代的抑郁狀行為和認知能力，以及孕鼠服用DHA后子代抑郁狀行為和認知能力的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選用40 d左右的未受孕過的C57雌性小鼠同批交配，在交配10～12 h后發現陰栓即為交配成功。選取30只成功受孕母鼠，隨機分為對照組、束縛應激組及DHA組。子鼠出生后正常飼養。所有小鼠均飼養在溫度為 (21±3)℃ 和濕度為55%±3%環境中, 小鼠可以自由的獲得食物并飲水。

1.2 實驗設計將孕鼠束縛應激21 h，每天腹腔注射DHA(10 mg/kg)。22 h后小鼠出生后正常飼養。在小鼠出生30 h后，進行強迫游泳實驗和懸尾實驗檢測小鼠的抑郁狀態，通過新物體識別實驗和新位置實驗評估小鼠的認知情況。并在行為實驗結束后，使用免疫組化法分析小鼠成年海馬神經發生的變化，實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程

1.3 抑郁模型孕鼠制備在母鼠交配成功當日，采用長時間束縛的方法，每天束縛母鼠4 h，連續21 d，覆蓋母鼠整個孕期(21 d左右)。DHA給藥組是在每天束縛結束后腹腔注射(i.p.)DHA(10 mg/kg)。束縛應激組是在每天束縛結束后腹腔注射生理鹽水。對照組是每天注射生理鹽水，沒有束縛。

1.4 子鼠抑郁行為檢測子鼠出生后4周通過懸尾實驗和強迫游泳實驗檢測小鼠的抑郁狀態。

1.4.1懸尾試驗 小鼠尾巴末端的1 cm用夾子固定, 懸掛在離地面高60 cm的架子邊緣, 懸掛6 min, 記錄最后4 min內小鼠的靜止時間。靜止狀態的標準定為小鼠沒有明顯的掙脫行為。

1.4.2強迫游泳實驗 將小鼠放入高50 cm、直徑20 cm的塑料圓桶中6 min， 桶中水高為25 cm，水溫維持在25 ℃±3 ℃, 記錄最后4 min內小鼠的靜止時間。靜止狀態的標準定為小鼠沒有明顯的掙脫行為。

1.5 新物體識別實驗和新位置識別實驗實驗在一個80 cm×80 cm的盒子中進行，本實驗是基于嚙齒類動物更喜歡探索新的物體，然后它們可以記住之前舊的物體的位置和形狀。

1.5.1新物體識別實驗 實驗前，將小鼠放入盒中適應30 min后，第2天再開始實驗。首先將兩個完全相同的物體放置在盒子的兩個角上，將小鼠放在盒子的正中心，讓小鼠自由探索30 min后，隨機取出一個物體，換另外一個新的物體，將小鼠重新放入盒中，觀察小鼠探索新放入物體的時間。探索比率= (探索新物的時間/探索總時間)×100%。

1.5.2新位置識別實驗 實驗前，將小鼠放入盒中適應30 min后，第2天再開始實驗。首先將兩個完全相同的物體放置在盒子的兩個角上，將老鼠放在盒子的正中心，讓小鼠自由探索30 min后，隨機移動一個物體至另外一個未被使用的角上，將小鼠重新放入盒中，觀察小鼠探索新移動物體的時間。探索比率= (探索新物的時間/探索總時間)×100%。

1.6 腦組織取樣及免疫組化① 腦片制備。海馬神經發生的部位只在海馬齒狀回，所有小鼠在處死前1 d注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu，50 mg/kg)用以追蹤海馬齒狀回神經干細胞的狀態。腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠后，經心臟灌注生理鹽水，再灌注4%福爾馬林溶液固定。取出腦后，繼續將腦部放入4%福爾馬林溶液后固定過夜。再分別用10%、20%和30%蔗糖溶液脫水各24 h。冷凍后，作厚度為30 μm的連續冠狀冰凍切片。腦片可置于PBS溶液中長期保存。② 免疫組化分析。腦片經過PBS洗滌后，BrdU抗體4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，使用熒光標記的二抗Alexa Fluor 488孵育2 h。PBS洗滌，然后用細胞核熒光劑DAPI孵育5 min。使用熒光顯微鏡觀察。③ 統計BrdU陽性細胞數目。將海馬以30 μm的連續冠狀冰凍切片，每個海馬可以獲得60～70片腦片。從每連續10片腦片隨機選取4片腦片進行免疫組化處理。隨后，手動數BrdU陽性細胞數目。由于海馬神經發生僅僅發生在顆粒細胞下層，其余位置也會有細胞分裂，但是不是神經干細胞分裂，有可能是膠質細胞分裂。為了更一致的統計結果，規定顆粒細胞層下0.5 mm為顆粒細胞下層，只統計在顆粒細胞下層BrdU陽性細胞數目。面積(mm2)=0.5 mm×顆粒細胞下層的長度(mm)。長度通過Image J軟件測量。

2 結果

2.1 DHA對抑郁模型孕鼠子代抑郁狀態的影響強迫游泳和懸尾實驗在小鼠出生后30 d進行。在強迫游泳實驗中發現孕期應激的孕鼠子代較正常小鼠不動時間更長(F=66.4，P<0.001)，見圖2A，而孕期應激的孕鼠在服用DHA后，其子代的不動時間相對于束縛應激組小鼠顯著縮短(P<0.001)，見圖2A。隨后的懸尾實驗中也得到了類似的結果，孕期受到束縛應激的孕鼠，其子代不動時間也顯著高于對照組小鼠(F=189.3，P<0.001)和孕期DHA喂食孕鼠的子代小鼠(P<0.001)，見圖2B。

2.2 DHA對抑郁模型孕鼠子代記憶能力的影響新物體識別實驗和新位置識別實驗在小鼠出生后30 d進行。在新物體識別實驗中，相較于正常小鼠，束縛孕鼠子代對于新物體的偏好降低，表現在其對新物體探索的時間比例降低(F=40.4，P<0.001)，見圖3B。但是這種降低可以通過在孕期補充DHA而逆轉。相對于沒有補充DHA的孕鼠子代，補充DHA的孕鼠子代對新物體偏好增加，表現在其對新物體探索的時間比例增加(P<0.001)，見圖3B。在新位置識別實驗中，束縛孕鼠子代對于處于新位置的物體偏好降低，表現在其對新位置的物體探索的時間比例降低(P<0.001)，見圖3D。但是在孕期補充了DHA孕鼠子代，相較于沒有補充DHA孕鼠子代，對新位置的物體的偏好增加，表現在其對新位置的物體探索的時間比例增加改善(P<0.001)，見圖3D。

2.3 DHA對抑郁模型孕鼠子代成年海馬神經發生的影響采用免疫組化的方法分析小鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層中BrdU陽性細胞的數目。實驗在小鼠行為學實驗結束后進行。相較于正常小鼠，束縛孕鼠子鼠海馬齒狀回顆粒細胞下層中BrdU陽性細胞的數目明顯降低(F=60.2，P<0.001)，見圖4。但是這種降低可以通過在孕期補充DHA而逆轉。相對于沒有補充DHA的孕鼠子代，補充DHA的孕鼠子代海馬齒狀回顆粒細胞下層中BrdU陽性細胞的數目增加(P<0.001)，見圖4。

3 討論

本研究觀察到孕期抑郁可引起子代抑郁行為，并且該抑郁行為可以被DHA減緩改善。強迫游泳和懸尾實驗結果顯示孕鼠在長期的束縛應激條件下會引起子代產生抑郁樣的行為。這是由于胚胎期腦熒光顯微鏡下統計小鼠海馬中BrdU陽性細胞數,圖中箭頭所指細胞為BrdU陽性細胞；A：對照組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；B：束縛組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；C：DHA組小鼠的海馬BrdU免疫組化圖；D：不同組小鼠海馬中BrdU陽性細胞數目統計結果；與對照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

部的發育對于外界應激非常敏感，圍產期抑郁母親會導致子代終生腦功能的改變，并對子代造成認知、行為和情緒的問題[6]。在應激孕鼠補充DHA后，發現DHA可以減緩子代鼠因母鼠孕期抑郁引起的抑郁狀行為。之前的研究[5]表明，具有圍產期抑郁的孕婦相較于正常孕婦，其DHA的含量顯著降低，增加DHA的補充可以降低獲得圍產期抑郁的風險。本研究顯示DHA不僅僅有助于降低獲得圍產期抑郁的風險，同時還可以達到治療和改善子代小鼠的作用。

圖2 DHA對抑郁模型孕鼠子代抑郁狀態的影響A：懸尾試驗； B：強迫游泳實驗；與對照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

圖3 DHA對抑郁模型孕鼠子代認知能力的影響

A：新物體識別實驗的實驗流程示意圖；B：新物體識別實驗統計結果；C：新位置識別實驗的實驗流程示意圖；D：新位置識別實驗統計結果；與對照組比較：***P<0.01；與DHA組比較：###P<0.001

圖4 DHA對抑郁模型孕鼠子代成年海馬神經發生的影響×10

海馬在大腦中參與記憶和情感控制，一般認為背側海馬參與學習和記憶，腹側海馬參與情感控制。抑郁情況下會引起海馬結構和功能異常[7]。海馬功能異常會導致和海馬依賴性認知功能受損。產前應激對胚胎的發育產生影響，導致胚胎海馬發育受損[8]，但是海馬發育受損是否對子代認知功能產生影響，還不清楚。因此，本研究采用新物體識別實驗和新位置識別實驗研究產前應激對子代記憶的影響。結果表明產前應激子代小鼠對于新物體和新位置的物體的探索時間相較于正常小鼠下降，顯示產前應激可導致小鼠海馬依賴性的記憶能力下降。DHA處理后，子代小鼠對于新物體和新位置的物體的探索時間增加，該結果顯示海馬依賴性的記憶能力得到了改善。這些結果顯示DHA不僅可能通過改善海馬功能，增加認知作用[9]，也可以改善胚胎期海馬發育過程的損傷。

海馬齒狀回顆粒細胞下層是成年大腦中少數幾個具有神經干細胞的區域。神經干細胞分化生成新的神經元的過程稱為成年海馬神經發生(adult hippocampal neurogenesis, AHN)。AHN和海馬的結構功能密切相關，海馬形態和功能發生改變會導致AHN降低[10]。增加AHN可以恢復海馬的結構和功能[11]。本研究證實了產前抑郁會對子代AHN的影響，反映在應激孕鼠的子代AHN顯著降低。應激孕鼠在補充DHA后，子代的AHN恢復接近正常小鼠。這提示DHA可減輕或修復胚胎因應激引起的海馬發育損傷，其方式可能和增強海馬的神經發生相關。

綜上所述，DHA可在應激孕鼠模型中明顯改善子代小鼠的類抑郁行為以及認知功能下降，其可能機制和DHA改善子鼠海馬神經發生有關。首先，DHA不僅僅改善圍產期抑郁孕婦的抑郁行為，而且對于因抑郁引起子代的腦發育損傷導致抑郁行為也有顯著的改善作用。其次，之前的研究[12]發現抑郁孕鼠也會引起子代的抑郁行為，引起子代抑郁的原因很多，本研究發現子代抑郁行為可能和神經發生降低有關。DHA作為神經發育至關重要的分子，可改善因圍產期抑郁引起的子代腦部發育損傷。孕期補充DHA可以改善子鼠因海馬神經發生，降低子代的抑郁行為。