冷凍消融術治療Lewis肺癌小鼠移植瘤侵襲轉移的實驗研究

孫滿強，胡凱文，陳 琪，何樂毅凡，龐皓玥，李龍宇，周 天

冷凍消融術作為一種新興的微創治療技術具有低損傷、可重復的優點，目前冷凍消融術復溫常采用兩種復溫范圍，分別是20 ℃～40 ℃和0 ℃～15 ℃，術者在復溫選擇時常常依據經驗和習慣。當前關于冷凍消融機制的研究多體現在免疫方面，冷凍消融術不具有擴大型手術的特性，關于術后不同復溫溫度對殘存瘤的侵襲性和轉移性影響的實驗研究較少。堿性-環-螺旋蛋白(Twist)是編碼位于常染色體的堿性-環-螺旋DNA結合轉錄因子，在正常胚胎發育中調控細胞運動及組織重組，因其被發現在腫瘤轉移過程中起關鍵調控作用而備受關注，可調控上皮—間充質細胞轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)和血管新生[1]。該實驗采用免疫組化法檢測Twist、鈣黏附蛋白E(E-Cadherin)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白的表達，探究冷凍消融術后冰球復溫溫度與殘存瘤侵襲轉移能力的關系。

1 材料與方法

1.1 動物和瘤株45只SPF級C57BL/6小鼠，4～5周齡，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2014-0004。Lewis肺癌小鼠細胞(lewis lung cancer，LLC)購自美國CA公司。LLC細胞用含10%FBS(英國Biochrom公司)的RPMI1640培養基(美國Corning公司)進行培養，放置于37 ℃、5%CO2培養箱中。待細胞生長狀態最佳時進行收集，用完全培養基將細胞濃度調整為1×107/ml，對小鼠進行皮下注射造模。

1.2 主要儀器和試劑冷凍消融術采用海杰亞CHS 800001手術系統，購自北京海杰亞醫療器械有限公司；Leica2135石蠟病理切片機、Leica病理組織包埋機購自德國Leica公司；顯微鏡購自日本Olympus公司；Anti-Twist單克隆抗體購自美國Abcam公司；Anti-E-Cadherin單克隆抗體、Anti-VEGF-A單克隆抗體、Anti-VEGF-C單克隆抗體、羊抗兔/鼠IgG H+L抗體(二抗)購自美國Proteintech公司。

1.3 造模取100 μl細胞懸液(106個細胞)皮下注射于45只小鼠右側背部。密切觀察小鼠生長狀況。

1.4 超低溫冷凍消融術造模24 d后，將45只荷瘤小鼠隨機分為3組，分別為對照組、復溫至0 ℃組(T0組)、復溫至40 ℃組(T40組)，每組15只。對照組未予任何干預，T0組予100 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定后，備皮，消毒，采用海杰亞冷凍消融設備實行冷凍手術。將1.66 mm冷凍刀頭插入腫瘤中央，采用單循環冷凍方法，當冷凍范圍到達癌旁組織時開始升溫，直到腫瘤中心溫度到達0 ℃，停止復溫，拔出探針。T40組操作如上，當腫瘤中心溫度達到40 ℃時，拔出探針。冷凍消融術第1天記為第0天(Day0，D0)。

1.5 取材小鼠的體質量每隔1 d記錄1次，在術后第14天(D14)進行脫頸處死，剝離腫瘤并進行稱重，計算腫瘤抑制率=([對照組平均腫瘤重量]-[實驗組平均腫瘤重量])/[對照組平均腫瘤重量]×100%。腫瘤稱重后放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.6 免疫組化染色法檢測取包埋后的組織修剪邊緣后裝入切片機作4 μm切片，烘箱過夜進行脫蠟，脫蠟后將標本進行阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗后將標本架置于pH 9.0 抗原修復液中進行修復(置于微波爐中高火7 min，中低火15 min)，用自來水復溫后取適量Anti-Twist抗體用一抗稀釋液稀釋至合適濃度(稀釋濃度1 ∶100)孵育標本30 min，沖洗后滴加二抗孵育20 min，最后進行DAB顯色，封片后用顯微鏡觀察Twist蛋白表達及分布(按照抗體說明書及文獻，Twist陽性表現為胞核出現黃色或棕色的顆粒狀物質沉積)。Twist蛋白表達水平以平均光密度值(Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像所得)表示。同理，按照上述實驗方法進行E-Cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白檢測。

2 結果

2.1 小鼠冷凍消融術后體質量比較對小鼠術后各時間段體質量進行統計分析，見表1。對照組小鼠體質量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義。

2.2 各組小鼠腫瘤質量及抑瘤率計算對照組腫瘤質量大于T0組和T40組(P<0.05)，T0組平均腫瘤抑制率為25.14%，T40組平均腫瘤抑制率為15.85%，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義，見表1。

2.3 各組腫瘤組織中Twist、E-cadherin、VEGF-A、VEGF-C蛋白的表達免疫組化染色結果顯示，高倍鏡下觀察，用細胞內棕黃色強弱來判斷腫瘤細胞內蛋白表達的高低，結果以平均光度值來表示。T0組Twist表達低于對照組(P<0.05)，T40組Twist表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義。T0組E-Cadherin表達高于對照組(P<0.05)，T40組E-Cadherin表達高于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義。T0組VEGF-A表達低于對照組(P<0.05)，T40組VEGF-A表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義。T0組VEGF-C表達低于對照組(P<0.01)，T40組VEGF-C表達低于對照組(P<0.05)，T0組與T40組之間比較，差異無統計學意義。見圖1、2。

表1 各組小鼠體質量和腫瘤質量變化

與對照組比較：*P<0.05

3 討論

冷凍消融手術具有安全、有效、微創、副作用小等優點，目前已廣泛應用于中晚期肺癌、肝癌、腎癌、前列腺癌等惡性腫瘤的治療[2-3]。當前國內外關于氬氦刀抗腫瘤效應的機制研究主要體現在溶解效應、凋亡效應、微血栓形成和免疫效應4個方面[4-8]。0 ℃以上的復溫溫度均可使冰球融化，但是不同復溫溫度是否會對殘存瘤侵襲轉移產生影響的相關研究較少。

當前研究[9-10]表明，EMT和血管新生是腫瘤侵襲轉移的重要環節。EMT過程可使具有極性特點的上皮細胞轉化為可移動的間質細胞，利于腫瘤的侵襲和轉移[9]。E-Cadherin減少是EMT過程中的重要表現[11-12]。腫瘤組織血流供應增強是腫瘤惡性程度的重要標志，VEGF具有促內皮細胞生長、增加血管通透性，以及協助腫瘤細胞進入脈管系統等作用[13]。VEGF-A主要促進血管內皮新生，VEGF-C主要促進淋巴管內皮新生。而Twist蛋白對于E-Cadherin 和VEGF均有調控作用，Twist在多種人類腫瘤中表達上調，并直接導致E-cadherin表達下調，致使上皮細胞間黏附力降低，細胞失去上皮特征、從原位脫落、運動能力加強，并在侵襲帶形成偽足、組裝張力絲并召集細胞基質降解酶，為侵襲轉移提供了必要前提[10]。轉染Twist的腫瘤細胞可增加VEGF的表達，促進腫瘤微血管、微淋巴管生成，而通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)下調Twist則可見VEGF表達量下降，通過RT-PCR檢測得其mRNA呈同樣變化趨勢[14]。由此得知Twist、E-Cadherin、VEGF是腫瘤侵襲轉移過程的重要蛋白，而E-Cadherin和VEGF的表達受Twist調控。

圖1 各組腫瘤組織免疫組化結果 ×400

圖2 各組腫瘤組織中Twist平均光密度值 與對照組比較：*P<0.05

本實驗結果顯示，實驗組小鼠在手術之后體質量減少，這與剪開皮毛，暴露腫瘤的手術損傷有關。對照組腫瘤質量大于T0組和T40組(P<0.05)，表明冷凍消融術對腫瘤起到抑制作用。進一步行免疫組化發現，相比對照組，T0組和T40組的Twist、VEGF-A、VEGF-C蛋白表達降低，E-Cadherin蛋白表達增高(P<0.05)。T0組和T40組在腫瘤抑制率和相關蛋白表達方面差異雖無統計學意義，但T0組在各項數據統計方面均優于T40組。由此得出：冷凍消融術后0 ℃復溫相較于40 ℃復溫對于腫瘤的侵襲性和轉移性具有更好的抑制作用，其機制與抑制上皮間質轉化和腫瘤血管新生兩個過程有關。氬氣和氦氣是稀有氣體，具有很高的價值性和戰略性，0 ℃復溫符合環保節能的原則，此實驗結果對于氬氦刀術后復溫溫度選擇具有一定指導意義。本研究只從組織層面對實驗目的進行驗證，缺少基因轉錄層面的驗證，并且腫瘤的表觀層面缺乏更強的說服性，以上是本實驗的不足和待改進之處。除此之外，冷凍消融對腫瘤微環境的影響是多方面的，以上只是從轉移角度進行探索，在炎癥、免疫方面的探索將是后續的研究方向。