FEZF1-AS1在惡性腫瘤中的表達及調控作用研究

周原世,徐書婉,夏浩明綜述 姜興明審校

2018年全球癌癥生存趨勢監測報告顯示，腫瘤依然是全球亟待解決的重要公共衛生問題[1]。近幾年非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)與腫瘤的關系成為研究的熱點，根據ncRNA的長度，將其分為微小RNA和長度大于200 nt的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)[2-3]。LncRNA能夠在轉錄、翻譯、染色質修飾及蛋白質激活等分子生物學過程中發揮重要作用，調控基因的表達，影響腫瘤的發生發展[4-6]。近年來的研究發現，lncRNA不僅能夠調控腫瘤的發生發展，而且在腫瘤的診斷治療等方面有著潛在的應用[7-10]。FEZF1-AS1(Fez family zinc finger protein 1-antisense RNA 1)作為一種新發現的lncRNA，在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發生發展密切相關，在腫瘤的基因診斷、治療和預后評估等方面有著潛在的應用前景。文章就FEZF1-AS1在腫瘤發生發展中的作用機制及研究前景作一綜述。

1 FEZF1-AS1概述

FEZF1-AS1定位于人類染色體7q31.32區域，全長6 420 nt，由7號染色體正鏈，即它的同源基因FEZF1( Fez family zinc finger protein 1 )的相反鏈轉錄而來，包含7個外顯子且具有相對保守的序列，且FEZF1-AS1第一個外顯子和FEZF1的外顯子1之間有611個核苷酸互補配對[6]。同時，研究發現，FEZF1-AS1有3種剪接變異體，分別是FEZF1-AS1-201 (679 bp, 1 exon)、 FEZF1-AS1-202 (2 653 bp, 3 exons)、 FEZF1-AS1-203 (768 bp, 1 exon) ，但是它們都不具有編碼蛋白質的能力。HPA(Human Protein Atlas project)項目對人類正常組織進行RNA測序發現，FEZF1-AS1在人類的睪丸和腦組織中表達水平居高[11]。目前已有的研究表明，FEZF1-AS1主要分布于胞核中，胞質中僅有少量分布，但是不管分布于哪里，它都發揮著重要的功能：FEZF1-AS1可以通過ceRNA(competitive endogenous RNA)模式或者招募多梳抑制復合體(polycomb repressive complex, PRC)等方式調節基因的表達及蛋白質磷酸化等分子生物學過程，調控腫瘤的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為，對腫瘤的發生發展產生重要的影響[12-13]，也將在腫瘤的診斷、治療及患者的預后評估中發揮重要的作用。

2 FEZF1-AS1與消化系統腫瘤

2.1 FEZF1-AS1與結直腸癌 Chen等[14]利用qRT-PCR(quantitative real time polymerase chain reaction)測得34組結直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)腫瘤組織中FEZF1-AS1較癌旁正常組織明顯高表達；原位雜交實驗及統計學分析顯示，FEZF1-AS1的過表達與CRC的T分期、淋巴結轉移和遠端轉移密切相關。細胞學實驗發現：抑制FEZF1-AS1的內源性表達能夠明顯地減少HCT116和M5細胞的增殖；敲低FEZF1-AS1導致G0/G1期細胞比例升高，S期細胞比例降低，而凋亡細胞的比例變化不大，即FEZF1-AS1促進CRC細胞的增殖是通過調控細胞周期實現的，而非通過抑制凋亡；Matrigel侵襲實驗及細胞劃痕實驗證實，沉默FEZF1-AS1能夠明顯地抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移；肺轉移實驗表明，FEZF1-AS1能抑制腫瘤在裸鼠體內的生長和轉移；進一步實驗發現，抑制FEZF1-AS1的表達降低了同源基因FEZF1 mRNA及蛋白質的表達，FEZF1-AS1和FEZF1的表達呈正相關。Kaplan-Meier分析表明FEZF1-AS1的高表達和患者的總體生存率密切相關；單變量及多變量分析證實FEZF1-AS1可以作為獨立因子預測CRC的預后。Bian等[15]對FEZF1-AS1與結直腸癌的關系做了更為詳細的研究，首先對CRC和正常結直腸組織進行基因芯片分析，最終篩選出52個在CRC組織中高表達，在正常結直腸組織中低表達的lncRNA，其中FEZF1-AS1表達尤為突出。CCk-8及克隆形成實驗表明，沉默FEZF1-AS1導致CRC細胞的增殖和克隆受到顯著抑制；流式細胞術結果顯示高表達FEZF1-AS1促進了腫瘤細胞從G1到S期的推進，抑制了其凋亡；Transwell實驗證實敲低FEZF1-AS1能夠抑制HCT116細胞的遷移和侵襲；在裸鼠體內進行成瘤實驗發現高表達FEZF1-AS1能夠促進CRC的肺轉移和肝轉移。RNA pull-down實驗及質譜分析預測出丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase 2, PKM2)是FEZF1-AS1相關蛋白，Western blot及RNA免疫沉淀實驗(RNA immunoprecipitation, RIP)證實PKM2及其激活狀態下均能夠與FEZF1-AS1直接結合；進一步研究發現FEZF1-AS1能夠在轉錄后水平上通過調節泛素化途徑，阻礙PKM2的降解，延長PKM2的半衰期，增加它的穩定性，促進糖酵解的發生，進而加快腫瘤細胞的代謝；生物信息分析發現信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription3, STAT3)能夠被FEZF1-AS1和PKM2所調節，后續實驗證實FEZF1-AS1和PKM2均能促進STAT3的磷酸化，加快CRC的進展。同時，他們進行統計學分析也發現，FEZF1-AS1的高表達給患者帶來了更差的預后。

2.2 FEZF1-AS1與胃癌 有研究指出[16]，過表達FEZF1-AS1能夠促進MGC-803細胞的增殖；流式細胞術結果顯示，抑制FEZF1-AS1的表達能夠通過阻滯胃癌細胞停滯在G1期并誘導細胞發生凋亡；將Sh-FEZF1-AS1轉染的SGC-7901細胞注入14只裸鼠皮下，2周后發現Sh-FEZF1-AS1組的腫瘤體積更小，質量更輕。RIP及RNA pull-down實驗證實，FEZF1-AS1能通過結合組蛋白去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1, LSD1)在表觀遺傳學水平抑制P21的表達；染色質免疫沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation, ChIP)表明，LSD1能直接結合P21的啟動子，誘導組蛋白第三亞基四號賴氨酸的二甲基(dimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit, H3K4me2)發生去甲基化，抑制p21的表達，促進胃癌的發生發展。Gu等[17]所在團隊對3例胃腺癌患者的癌組織進行高通量測序獲得lncRNA和mRNA在胃癌中的表達譜，確定lncRNAs/mRNAs在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達差異并構建lncRNA/mRNA共表達網絡，同時利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫分析等方式進行驗證，最終確定出9個對胃腺癌有潛在診斷價值的lncRNA，其中就包括FEZF1-AS1。Wu等[18]及其團隊對104例胃癌組織和癌旁正常組織進行RNA測序并分析發現，FEZF1-AS1在胃癌組織中高表達，且FEZF1-AS1和胃癌分化程度及分期明顯相關。生存分析和時序檢驗結果表明，FEZF1-AS1高表達的患者生存時間更短；受試者工作特征曲線分析證明，FEZF1-AS1對胃癌診斷來說可能是一個敏感度和特異度都相對較高的潛在標志。qRT-PCR測得MGC-803和MKN-49P中FEZF1-AS1穩定高表達，用si-RNA轉染2種細胞，FEZF1-AS1表達下調，且2種細胞的生存能力明顯降低；流式細胞術結果顯示，沉默FEZF1-AS1導致腫瘤細胞停滯在G0/G1期，凋亡細胞數增多。Western blot實驗結果表明，沉默腫瘤細胞中的FEZF1-AS1，β-catenin、c-Myc和cyclin D1的表達顯著減少，E-cadherin表達增加，即FEZF1-AS1可能通過Wnt/β-catenin信號通路促進胃癌的發展。龔丹丹等[19]的研究也發現，FEZF1-AS1在胃癌SGC-7901細胞中過表達且能通過調控Wnt/β-catenin信號通路調節胃癌的進展。另有研究發現，FEZF1-AS1與胃癌的異時性肝轉移密切相關[20]。目前看來，關于胃癌發生發展的研究從基因、RNA到蛋白繁雜多樣[21]，這就使得胃癌發生發展的機制顯得更為復雜，也讓人們從多個方面了解胃癌。

2.3 FEZF1-AS1與肝細胞癌 Wang等[22]的研究指出，FEZF1-AS1在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)組織和細胞中明顯高表達，且FEZF1-AS1的高表達和腫瘤的大小、TNM分期、血管侵襲及預后顯著相關。細胞實驗表明，沉默HCC細胞中的FEZF1-AS1，G0/G1期細胞比例上升，S期細胞比例下降，腫瘤細胞的增殖受到抑制，且HCC細胞的遷移、侵襲以及在裸鼠體內的生長都受到了明顯抑制。Western blot實驗證實，敲低FEZF1-AS1抑制了N-cadherin和Vimentin的表達，促進了E-cadherin蛋白的表達，抑制了腫瘤細胞的上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)進程；JAK/STAT3信號通路能夠調節EMT進程，沉默FEZF1-AS1能夠明顯地抑制JAK2的表達和STAT3的磷酸化。上述實驗表明，FEZF1-AS1能夠通過調節JAK/STAT3信號通路加快EMT進程，促進HCC的發生發展。此外，肝細胞癌術后復發嚴重影響肝細胞癌患者的預后，是肝細胞癌治療當中的疑難雜癥[23]，目前還未有FEZF1-AS1在肝細胞癌術后復發中的研究報道，這值得進一步研究。

2.4 FEZF1-AS1與胰腺導管腺癌 Ye等[24]發現FEZF1-AS1在胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)組織中明顯高表達且過表達的FEZF1-AS1及其同源基因ZNF312B和PDAC的分化類型、高級別的AJCC分期、神經侵犯及較差的預后密切相關。免疫組化實驗結果顯示，ZNF312B高表達的PDAC組織，FEZF1-AS1也高表達，雙變量分析證明兩者之間呈正相關；下調FEZF1-AS1和ZNF312B能夠明顯地抑制PDAC細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲，且能夠抑制腫瘤在裸鼠體內的生長；生物信息學分析發現miR-107能夠靶向FEZF1-AS1和ZNF312B，從而提出FEZF1-AS1/miR-107/ZNF312B調控軸；并且還發現該調控軸對腫瘤細胞的Warburg效應維持具有重要作用。

3 FEZF1-AS1與生殖系統腫瘤

3.1 FEZF1-AS1與宮頸癌 Zhang等[25]利用RT-PCR測定發現，FEZF1-AS1在宮頸癌組織及細胞中明顯高表達。將196例患者分為高表達組和低表達組，進行臨床病理資料分析發現，FEZF1-AS1的過表達和高級別組織學分型、遠端轉移及晚期FIGO分期密切相關。在平均44個月的隨訪中，生存分析結果表明，FEZF1-AS1高表達的患者總體生存率更低，生存時間更短。單變量分析表明組織學分級、癌腫轉移、FIGO分期和FEZF1-AS1的表達水平都與較差的預后相關，多變量分析證實FEZF1-AS1是宮頸癌預后的獨立預測因子。

3.2 FEZF1-AS與卵巢癌 Zhao等[26]研究發現FEZF1-AS1在卵巢癌組織和細胞系中明顯過表達，生存分析結果表明，FEZF1-AS1的過表達給卵巢癌患者帶來了更差的預后。CCK-8實驗結果證實，下調FEZF1-AS1的表達能夠明顯地抑制ES2細胞的增殖，誘導其凋亡的發生。進一步對FEZF1-AS1促進卵巢癌進展的機制進行研究發現，STAT3起到促進卵巢癌發生發展的作用，而過表達FEZF1-AS1能夠促進STAT3的表達及磷酸化，抑制FEZF1-AS1的表達則對STAT3起到相反的的作用，即FEZF1-AS1能夠通過促進STAT3的表達及磷酸化來激活JAK-STAT3信號通路促進卵巢癌的發生、發展。

4 FEZF1-AS1與肺癌

He等[27]研究者利用qRT-PCR測出FEZF1-AS1在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組織和細胞中高表達；統計學分析還發現，FEZF1-AS1的高表達和淋巴結轉移、低分化等級以及晚期TNM分期密切相關。用si-RNA干擾FEZF1-AS1在A549和SPC-A1中的表達，MTT及克隆形成試驗表明，下調FEZF1-AS1的表達明顯降低了腫瘤細胞的增殖能力；Transwell實驗則證實，下調FEZF1-AS1的表達對腫瘤細胞的侵襲有著顯著的抑制作用。Western blot實驗結果表明，沉默NSCLC細胞中的FEZF1-AS1能夠抑制轉錄因子Slug、Twist和Vimentin的表達，增加E-cadherin及ZO-1蛋白的表達，即FEZF1-AS1能夠促進腫瘤細胞的EMT進程。RIP及ChIP實驗發現，FEZF1-AS1能夠直接結合 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)和LSD1，而EZH2和LSD1能夠與E-cadherin的啟動子區域相結合發揮脫甲基作用，即沉默FEZF1-AS1能夠上調E-cadherin的表達；此外，下調FEZF1-AS1的表達能夠明顯地增加Axin1的表達，減少β-catenin的表達，這表明FEZF1-AS1能夠調節NSCLC中的Wnt/β-catenin信號通路，參與NSCLC的發生發展。Jin等[28]及其團隊發現FEZF1-AS1在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LAD)組織和細胞中高表達，且和腫瘤的大小、TNM分期、淋巴結轉移及預后明顯相關。細胞實驗結果表明，干擾FEZF1-AS1的表達能夠將LAD細胞阻滯在G1期，抑制腫瘤細胞的增殖，促進其凋亡的發生。進一步實驗發現，抑癌基因p57在LAD組織中顯著低表達，沉默FEZF1-AS1能夠明顯地提高抑癌基因p57的表達水平；RIP及ChIP實驗證實，FEZF1-AS1能夠與EZH2和LSD1相結合，誘導它們結合到p57基因的啟動子區域，使p57基因的啟動子發生去甲基化，抑制p57基因的表達，導致細胞抑癌和抗癌基因表達的失衡，細胞發生惡性質變。此外，有研究指出沉默A549和SPC-A1細胞中的內源性FEZF1-AS1，FEZF1 mRNA及蛋白的表達水平都降低；利用si-RNA敲低FEZF1蛋白編碼基因的表達，FEZF1-AS1的表達也受到明顯抑制；統計學分析結果證實，FEZF1-AS1和FEZF1的表達呈明顯正相關[29-30]。

5 FEZF1-AS1與其他腫瘤

5.1 FEZF1-AS1與骨肉瘤 Zhou等[31]發現FEZF1-AS1在骨肉瘤(osteosarcoma, OS)組織及細胞中高表達，且與OS分期分型、轉移及預后顯著相關。沉默FEZF1-AS1能夠明顯地減少U2OS和MG63S期細胞的數目，降低其增殖能力，同時能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移及減緩腫瘤在裸鼠體內的生長，顯著地減小肺轉移瘤的體積。生物信息預測及熒光素酶報告分析證實，miR-4443能和FEZF1-AS1直接結合，且FEZF1-AS1上只有一個miR-4443結合位點；過表達miR-4443能夠抑制OS細胞中FEZF1-AS1的表達。進一步實驗發現miR-4443能夠與NUPR1 mRNA的3’-非翻譯區域(untranslated region, UTR)相結合，且miR-4443過表達抑制了NUPR1 mRNA和蛋白質的表達，過表達FEZF1-AS1則能夠上調腫瘤細胞中NUPR1 mRNA的水平。綜上所述，FEZF1-AS1促進OS的發生發展，一部分是通過調節miR-4443/NUPR1軸實現的。

5.2 FEZF1-AS1與乳腺癌 乳腺癌已成為女性健康的一大殺手，近年來關于乳腺癌方面的分子機制研究也逐漸增多。研究發現FEZF1-AS1在乳腺癌組織和細胞中表達明顯被上調，且FEZF1-AS1高表達患者的總體生存率更低，預后更差[32]。低表達FEZF1-AS1導致CD44+/CD24-乳腺癌干細胞樣細胞(breast cancer-stem like cells, BCSC)及干細胞因子Nanog、OCT4及SOX2減少，降低了BCSC的成球能力，腫瘤細胞的干細胞能力被削弱。FEZF1-AS1主要位于胞質中，沉默FEZF1-AS1抑制了MDA-MB-231和MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲以及腫瘤細胞在體內的生長。實驗發現，miR-30a和FEZF1-AS1 3’-UTR之間有7個堿基互補配對，兩者能直接結合，且miR-30a能夠抑制FEZF1-AS1在腫瘤細胞中的表達。進一步研究發現，miR-30a和Nango mRNA的3’-UTR相結合，且能夠FEZF1-AS1和Nango mRNA及蛋白的表達。即FEZF1-AS1能夠通過對FEZF1-AS1/miR-30a/Nango軸的調節，影響乳腺癌的發生發展。從另一方面來說，對乳腺癌干細胞的研究也能為乳腺癌的治療及預后評估帶來巨大效益[33-34]。

5.3 FEZF1-AS1與多發性骨髓瘤 Li等[35]通過qRT-PCR測得FEZF1-AS1在多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)組織和細胞中高表達；干擾U266細胞中FEZF1-AS1的表達，能夠阻止腫瘤細胞從G1到S期的轉變，抑制腫瘤的增殖，增加U266細胞的凋亡。數據庫分析發現，miR-610能夠和FEZF1-AS1 3’-UTR結合，且miR-610與FEZF1-AS1的表達呈負相關。研究發現，用miR-610 mimics轉染的U266細胞中Akt3(protein kinase B3)表達水平降低；在MM樣本中，Akt3 mRNA的表達明顯增加且與miR-610的表達呈負相關；沉默FEZF1-AS1能夠減少Akt3 mRNA和蛋白的表達，FEZF1-AS1與Akt3的表達呈正相關。這表明FEZF1-AS1能夠通過調節miR-610/Akt3軸促進MM細胞的增殖。

5.4 FEZF1-AS1與鼻咽癌 Cheng等[36]經過研究發現，FEZF1-AS1在鼻咽癌組織和細胞中較正常組織和細胞中明顯高表達，且高表達的FEZF1-AS1與鼻咽癌的遠端轉移及患者較差的總體生存率、較低無的病生存率密切相關。敲低5-8F細胞中FEZF1-AS1的表達，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲受到顯著抑制，p21表達被上調，cyclin D1表達被下調。此外，下調FEZF1-AS1的表達能夠明顯地抑制腫瘤在裸鼠體內的生長。進一步研究發現，干擾FEZF1-AS1的表達能夠明顯地促進E-cadherin的表達，抑制N-cadherin和Vimentin的表達從而抑制腫瘤細胞的EMT進程；同時也增加了β-catenin的表達，激活Wnt/β-catenin信號通路。

6 小結及展望

FEZF1-AS1作為新發現的lncRNA，主要通過ceRNA或者招募PRC2的方式，調節腫瘤細胞內某些蛋白質的磷酸化以及染色質甲基化等表觀遺傳學修飾，調控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞代謝，但FEZF1-AS1在其他方面的作用及機制仍需進一步研究。目前看來，FEZF1-AS1的研究僅限于腫瘤方面，并無在其他疾病中的報道。相信隨著研究的逐步開展，上述謎團將被一一解開，FEZF1-AS1也可以在疾病尤其是惡性腫瘤的基因診斷、治療以及預后評估等方面發揮重要的作用，更好地服務于臨床實踐。