西北傳統(tǒng)食品中乳酸菌的分離及提高免疫力菌株的篩選

陳麗娥，孫盛，俞赟霞，李理，陳彩玲，翁璐溦，任學(xué)良，鄭志瑤，陳蘇

(杭州娃哈哈集團有限公司杭州娃哈哈科技有限公司浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州310018）

0 引 言

中國西北地區(qū)地域遼闊，氣候獨特，擁有豐富且歷史悠久的傳統(tǒng)食品。這其中有一些特性優(yōu)良的乳酸菌被保留了下來。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生大量乳酸的細菌的通稱。乳酸菌與人類的關(guān)系十分密切，不僅是人體消化道中的重要有益微生物群，還被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料發(fā)酵、醫(yī)療保健、禽畜的疾病防治等各個方面[1]。“通過攝入足夠數(shù)量，對宿主起有益健康作用的活的微生物”[2]被定義為“益生菌”。益生菌主要包括3類：乳酸菌類，真菌類（酵母和霉菌）和芽孢菌類[3]。

益生菌在人體健康的很多方面都有作用，例如腸道健康[4]、精神健康[5]、免疫健康[6]等。人體的免疫系統(tǒng)在抵御外來有害物質(zhì)的入侵方面發(fā)揮著重要的作用。益生菌在提高和調(diào)節(jié)免疫力方面的研究被廣泛關(guān)注[7-8]。He F等人發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌LGG增加小鼠腸黏膜IgA的分泌量，阻止病原菌感染上皮細胞，增強小鼠免疫力[9]。Raj Kumar Duary等人通過兩株植物乳桿菌Lp9和Lp91在LPS誘導(dǎo)的HT-29細胞中分泌促炎和抗炎細胞因子的研究，發(fā)現(xiàn)這兩株菌有免疫調(diào)節(jié)的功能[10]。Jang SE等人發(fā)現(xiàn)在免疫低下小鼠模型中，干酪乳桿菌HY7213可提高NK細胞活性，還可提高抗腫瘤細胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量，從而增加對致病菌的免疫反應(yīng)[11]。

本文從新疆、西藏、青海、四川等地采集到的酸奶、奶酪、泡菜、青稞酒等樣品中進行乳酸菌的分離、純化和保藏。對分離到的乳酸菌進行提高免疫力功能的菌株篩選，包括體外細胞實驗和造模免疫力低下動物實驗的篩選，最終獲得一株具有提高免疫力功能的發(fā)酵乳桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材

MRS培養(yǎng)基（OXOID公司），M 17培養(yǎng)基（BD公司），Elliker培養(yǎng)基（實驗室自配制），細菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物有限公司），PCR擴增試劑，無菌Hank’s液，10%胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基，臺盼藍，Con A，DMSO，IL-10和IL-12測定試劑盒（BD公司），96孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)瓶，環(huán)磷酰胺（上海源葉生物科技有限公司），鹽酸左旋咪唑(Solarbio)，印度墨汁，Na2CO3，PBS，中性紅，YAC-1細胞，乳酸鋰，硝基氯化四氮唑（INT），吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS），NAD，0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液（p H 8.2），鹽酸。

SPF級BALB/C小鼠140只，6～8周齡，18～22 g，許可證號碼：SCXK（滬2017-0005），采購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.1.2 儀器

SG403A-HE-INT超凈工作臺（BAKER），BX 50熒光顯微鏡（OLYMPUS），恒溫金屬浴（杭州博日科技有限公司），Basic電泳儀（BIO-RAD），Gel DOCTM XR+凝膠成像儀（BIO-RAD），Mastercy PCR儀（eppendorf），Model 680酶標儀（BIO-RAD），HV-110全自動高壓蒸汽滅菌鍋（SANYO），5810R/5430R/5417R離心機（eppendorf），KB400恒溫培養(yǎng)箱（BINDER），Galaxy 170S二氧化碳培養(yǎng)箱（eppendorf），DMI3000B倒置熒光顯微鏡（Leica）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的分離與保藏

適量的原始樣品（采集自新疆、西藏、貴州、云南、青海等地）加入到適當體積的無菌生理鹽水中,勻漿混勻后，生理鹽水10倍梯度稀釋，取適當?shù)南♂屘荻韧坎荚趯?yīng)的培養(yǎng)基（MRS、M 17、Elliker培養(yǎng)基）上，于相應(yīng)的培養(yǎng)條件培養(yǎng)48 h；從平板上挑取單菌落，在對應(yīng)的平板上進行劃線分純（一般需要至少劃線3代）。將革蘭氏染色陽性且鏡檢形態(tài)一致的菌落接種至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)液離心去上清，加入30%無菌甘油，分裝至凍存管，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌的分子鑒定

培養(yǎng)液離心去上清，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的步驟抽提DNA。以基因組DNA為模板，27F（5'-AGTCTCTGATCATGC-3'）和1492R（5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'）為正反向引物進行16SrDNA片段的擴增。擴增產(chǎn)物在上海生工生物有限公司測序。測序結(jié)果通過NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫比對。

1.2.3 乳酸菌的體外細胞篩選

（1）體外脾淋巴細胞增殖。

脾淋巴細胞增殖實驗，參考Park JH和HSGill等人的方法[12-13]，簡單描述如下：處死小鼠，無菌取脾臟，用眼科剪將脾臟剪碎后，用無菌的玻璃注射器芯將其碾碎，經(jīng)200目金屬篩網(wǎng)過濾后，加入含10%胎牛血清的無菌Hank’s液，1 000 r/min，4℃離心5 min，收獲細胞。加入5倍于細胞體積的細胞裂解液，裂解5 min，加入含10%胎牛血清的無菌Hank’s液終止裂解，1 000 r/min，4℃離心5 min去上清。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌，1 000 r/min，4℃離心5 min。洗滌兩次，沉淀重懸于5 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×106cells/mL。乳酸菌活化菌液4 000 r/min室溫下離心10 min去上清，PBS洗滌兩次，加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，調(diào)整其OD600至0.50±0.10。將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每個樣品3個平行。設(shè)置調(diào)零組（細胞培養(yǎng)基），空白對照組（細胞懸液+細胞培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑組（細胞懸液+10μg/mL Con A），乳酸菌組（細胞懸液+10μg/mL Con A+菌懸液），置二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)72 h。每孔加入20μL MTT溶液（2.5 mg/mL），37℃顯色4 h后，1 500 r/min，4℃離心10 min，吸出上清，再加入100μL DMSO，用酶標儀于490 nm下測定吸光值。

（2）脾淋巴細胞細胞因子檢測。

脾淋巴細胞細胞因子檢測，參考C Ai和T Jiang等人的方法[14-15]。細胞取材、紅細胞裂解、洗滌、細胞計數(shù)、益生菌培養(yǎng)同1.2.3.1。將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，每個處理5個重復(fù)，分為調(diào)零組（細胞培養(yǎng)基100μL），空白對照組（1×107cells/ml的細胞懸液100μL，細胞培養(yǎng)基100μL），益生菌組（1×107cells/mL的細胞懸液100μL，1×108cfu/mL菌懸液100μL），37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1 500 r/min離心10 min，吸取上清，0.22μm濾膜過濾，采用BD試劑盒測定IL-10和IL-12含量。

1.2.4 乳酸菌的免疫低下動物模型篩選

1.2.4.1 分組與給藥方法

本實驗采取隨機分組設(shè)計，將近交系BALB/C雄性小鼠140只，適應(yīng)期5 d，隨機分為7組（空白對照組、模型組、陽性對照組和4個菌株組各20只）。動物飼養(yǎng)保持環(huán)境溫度為21±2℃，濕度為30%～70%，12 h光照交替，自由飲水，自由攝入飼料。每三天換一次墊料，及時添加飼料和水。

采用免疫功能低下模型動物進行試驗。陽性對照組每天灌胃40 mg／kg鹽酸左旋咪唑，4個菌株組每天每只小鼠灌胃0.2 mL菌懸液（1×109CFU/mL），空白對照組和模型組給予等量無菌生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d，在第3周后開始除空白對照組外其余各組小鼠腹腔注射免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（40 mg／kg，連續(xù)兩天）。

1.2.4.2 檢測指標與方法

（1）臟器指數(shù)。

小鼠稱重。處死小鼠后無菌條件下取脾臟和胸腺，分別稱重，計算臟器比(mg/g)。

（2）脾淋巴細胞增殖反應(yīng)。

細胞取材、紅細胞裂解、洗滌、細胞計數(shù)同體外脾淋巴細胞增殖實驗。調(diào)整脾細胞濃度為3×106個/mL。將100 uL細胞懸液加入已加20 uL ConA液96孔培養(yǎng)板中，不加細胞的ConA液作為對照。每個樣品三個平行。置二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 uL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，離心10 min（1 000 r/min），棄上清，每孔加入100 uL DMSO使紫色結(jié)晶完全溶解。，用酶標儀570 nm波長測定OD值。用加ConA孔的OD值減去不加ConA孔的OD值代表淋巴細胞的增殖能力。

（3）NK細胞活性。

實驗前24 h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)，調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL。脾細胞取材、紅細胞裂解、洗滌、細胞計數(shù)同1.2.3.1。調(diào)整脾細胞濃度為2×107個/mL。取靶細胞和效應(yīng)細胞各100μL（效靶比50∶1），加入96孔培養(yǎng)板中。靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和2.5%Triton各100 μL。每個樣品三個平行。置二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 h。然后離心5 min（1 500 r/min），每孔吸取上清100μL置新的96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)3 min，每孔加入30μL1mol/L的HCl，用酶標儀490 nm波長測定OD值。

（4）碳廓清實驗[16]。

稱體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每10 g體重0.1 mL計算。待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2 min和10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20μL，并立即將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用分光光度計600 nm波長測定OD值，以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。計算碳廓清指數(shù)a。

（5）腹腔巨噬細胞吞噬作用[17]。

處死小鼠，腹腔注射4 mL1640培養(yǎng)基(加10%滅活胎牛血清)。吸出3 mL洗液，1 500 r/min離心5 min，去上清，重懸至1 640培養(yǎng)基，至細胞數(shù)為1×106cells/mL。每孔200 uL加入96孔板，置二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)3 h后，用PBS洗3次，吸出未黏附的細胞[18]。將黏附的細胞重懸在200 uL 1640培養(yǎng)基(加10%滅活胎牛血清)，置二氧化碳培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)基，每孔加入100 uL 0.072%中性紅，培養(yǎng)0.5 h。去除混合液，用PBS洗3次以除去多余的染液。吸干。細胞重懸于含1%冰醋酸的50%乙醇中，4℃過夜。用酶標儀540 nm波長測定OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從革蘭氏染色陽性、無運動性、鏡檢、16SrDNA分子鑒定結(jié)果顯示，共分離得到乳酸菌232株，其中桿菌142株，球菌90株，這些菌株均在《可食用菌種名單》中。

2.2 提高免疫力乳酸菌的體外細胞篩選

2.2.1 體外脾淋巴細胞增殖

對分離到的232株乳酸菌進行體外脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，在誘導(dǎo)劑ConA存在和不存在的情況下，均能顯著促進脾淋巴細胞增殖的益生菌作為優(yōu)選菌株。表1為效果前15位的菌株信息，有從酥油、泡菜、酸奶等樣品中分離得到的（副）干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌等多種菌種。

表1 促進體外脾淋巴細胞增殖的部分菌株

表1 促進體外脾淋巴細胞增殖的部分菌株

菌株編號1746 575 691 1889 2544 563 1668 1789 2480 1672 685 2679 675 1738 2556不加誘導(dǎo)劑倍數(shù)值2.652±0.551 2.445±0.140 2.406±0.378 2.390±0.323 2.364±0.217 2.355±0.154 2.264±0.056 1.659±0.167 1.912±0.087 1.715±0.084 1.968±0.209 1.505±0.116 1.649±0.211 1.653±0.124 1.928±0.189 ConA(10μg/mL)倍數(shù)值1.510±0.147 1.498±0.238 1.685±0.333 1.494±0.190 1.281±0.148 1.357±0.077 2.052±0.171 2.390±0.268 1.533±0.109 1.770±0.3132 1.502±0.187 1.795±0.250 1.839±0.196 1.536±0.128 1.308±0.104菌株信息采集地西藏四川青海西寧西藏青海西寧四川西藏?zé)崛鲟l(xiāng)多崗村西藏邊雄鄉(xiāng)新疆那拉提紅山溝西藏洛布村西寧阿拉山口市，博樂西寧西藏新疆托里縣城店樣品形式羊酥油泡菜3號酸奶酸奶酸奶泡菜14號青稞酒酸奶酸奶牦牛酥油酸奶酸奶酸奶酵頭（固態(tài)）牦牛酥油奶油鑒定信息（副）干酪乳桿菌植物乳桿菌發(fā)酵乳桿菌瑞士乳桿菌動物雙歧桿菌植物乳桿菌發(fā)酵乳桿菌羅伊氏乳桿菌瑞士乳桿菌瑞士乳桿菌植物乳桿菌干酪乳桿菌植物乳桿菌（副）干酪乳桿菌瑞士乳桿菌

2.2.2 體外脾淋巴細胞細胞因子測定

對具有促脾淋巴細胞增殖效果的77株菌（包括表1中的15株菌）進行脾淋巴細胞細胞因子IL-10和IL-12的測定。結(jié)合促進體外脾淋巴細胞增殖效果較好的菌株和IL-12/IL-10比值較高的菌株，篩選出具有免疫調(diào)節(jié)潛力的益生菌8株，見表2。

2.3 乳酸菌的動物實驗篩選

結(jié)合體外細胞實驗的結(jié)果，選取675、691、1738和1011四株菌進行動物實驗的篩選。

表2 體外脾淋巴細胞細胞因子IL-12和IL-10的測定

2.3.1 臟器指數(shù)

脾臟是T、B淋巴細胞定居和對抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答及免疫效應(yīng)物質(zhì)的重要器官。胸腺是T淋巴細胞發(fā)育成熟的場所。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)可間接反映機體的免疫水平。與空白組相比，模型組小鼠臟器比顯著降低，表明免疫低下小鼠造模成功。與模型組相比，菌株675、1011和691顯著提高臟器比（P＜0.05），脾臟指數(shù)（mg/g）從2.823分別提高到3.363、3.527和3.499，胸腺指數(shù)（mg/g）從0.885分別提高到1.225、1.178和1.232（見圖1）。可見這3株菌675、1011和691可促進免疫低下小鼠臟器的恢復(fù)。

圖1 各實驗組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定

2.3.2 脾淋巴細胞增殖反應(yīng)

淋巴細胞增殖能力的強弱直接影響到機體免疫水平。Jang SE等人在免疫低下小鼠模型中，模型組ConA誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖值僅為空白對照組的54%，而干酪乳桿菌HY7213處理組是空白對照組的95%，顯著提高淋巴細胞的增殖能力[11]。本研究中菌株1011和691顯著促進脾淋巴細胞的增殖，OD570值從 0.197分 別 提 高 到 0.264（P＜0.05）和 0.322（P＜0.001）。相比于模型組小鼠的OD 570值是空白對照組的58%，菌株691組小鼠的OD570值達到空白對照組的85%。如圖所示2。

圖2 各實驗組小鼠脾淋巴細胞增殖OD570的測定

2.3.3 NK細胞活性

NK細胞在免疫方面有重要的作用，是機體非特異性免疫的重要組成部分。本研究中，與模型組相比，菌株（副）干酪乳桿菌1011顯著提高NK細胞的活性，從51.9%提高到73.3%（P＜0.05）。而同樣是（副）干酪乳桿菌的1738，其NK細胞活性與模型組沒有顯著差異，表明菌株之間的差異性。菌株691極顯著提高NK細胞的活性，從51.9%分別提高到77.6%（P＜0.01），如圖3所示。

圖3 各實驗組小鼠NK細胞活性的測定

2.3.4 碳廓清實驗

小鼠碳廓清法，是利用測定血中異物的清除速度來反映單核吞噬細胞的吞噬功能的原理，間接的反映機體的免疫功能[19]。與模型組相比，菌株1738、1011和691顯著提高小鼠的吞噬指數(shù)，分別從3.371提高到4.127（P＜0.05）、4.256和4.250（P＜0.01），如圖4所示。表明這3株菌具有提高巨噬細胞清除異物的能力，提高機體的非特異性免疫力。

圖4 各實驗組小鼠碳廓清指數(shù)的測定

2.3.5 腹腔巨噬細胞吞噬作用

巨噬細胞是重要的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)細胞，通過吞噬和分泌多種細胞因子的途徑來控制機體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答。吞噬中性紅的強弱可間接反映巨噬細胞的吞噬能力。Yueyue Meng等人[17]考察小鼠巨噬細胞吞噬中性紅的能力，與模型組相比，OD540值從0.087提高到約0.14（P＜0.05）。本研究中，與模型組相比，菌株691 OD540值從0.136提高到0.162（P＜0.05），如圖5所示。表明菌株691具有提高小鼠的吞噬作用的能力。

圖5 中性紅法檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的結(jié)果

3 結(jié) 論

我國有極其豐富的傳統(tǒng)食品，不同來源的發(fā)酵制品中蘊藏著種類豐富的乳酸菌。本文從新疆等地采集的各種形式的傳統(tǒng)食品中分離得到232株乳酸菌。對這232株乳酸菌進行了體外細胞篩選，包括促進體外脾細胞增殖和脾淋巴細胞分泌細胞因子IL-10和IL-12的實驗。通過體外細胞實驗，篩選出4株可能具備免疫調(diào)節(jié)功能的菌株（675，1738，1011和691）。并對這4株菌進行動物實驗，采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建造免疫低下小鼠模型，最終確定發(fā)酵乳桿菌691具有提高免疫力的功能。

環(huán)磷酰胺主要是通過DNA烷基化破壞DNA的合成而非特異性殺傷淋巴細胞，并可抑制淋巴細胞轉(zhuǎn)化，造成小鼠的免疫力低下[20]。免疫器官胸腺及脾臟的臟器比值是衡量機體免疫狀況的初步指標[21]。發(fā)酵乳桿菌691顯著增加胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P＜0.01），有效的促進了免疫受損小鼠的臟器恢復(fù)。淋巴細胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應(yīng)答功能的重要細胞成分，具有免疫識別功能，可分為T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。自然殺傷(NK)細胞是機體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機體抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)中都起著重要作用[22]。益生菌促進淋巴細胞增殖和NK細胞的活性，說明在機體的體液免疫和細胞免疫兩方面都有作用。發(fā)酵乳桿菌691可以顯著刺激脾淋巴細胞增殖，實驗中的OD570值從0.197提高到0.322（P＜0.001），NK細胞活性從51.9%提高到77.6%（P＜0.01）。巨噬細胞作為最重要的抗原呈遞細胞，是誘發(fā)免疫應(yīng)答的先決條件，其作為非特異性免疫細胞可吞噬或殺傷癌細胞及外來異己細胞。單核巨噬細胞吞噬能力能夠有效衡量機體非特異性免疫功能，而巨噬細胞的碳廓清指數(shù)與吞噬指數(shù)可有效反映內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬功能的強弱，提高其吞噬活性可有效防衛(wèi)微生物侵襲[23-25]。發(fā)酵乳桿菌691碳廓清指數(shù)從3.371提高到4.250（P＜0.01）和吞噬實驗OD540值從0.136提高到0.162（P＜0.05）。

本研究通過造模免疫力低下小鼠，飼喂乳酸菌，檢測臟器比、細胞免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性等方面，結(jié)果顯示，一株從青海西寧酸奶樣品中分離得到的發(fā)酵乳桿菌691具有提高免疫力的功能，促進環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制的恢復(fù)。