乳飲料中苯甲酸快速檢測試劑盒的研制及應用

陳百科，蔡錦明，王鈺鑫，韓如雁，陳涔，潘家榮，鄭方媛

（中國計量大學生命科學學院，杭州310018）

0 引 言

苯甲酸是弱酸，能形成鹽、酯、酰鹵、酰胺、酸酐等不易被氧化化合物。在酸性條件下，對霉菌、酵母和細菌均有抑制作用而作為食品、飼料、乳膠和牙膏的防腐劑，尤其作為乳飲料中的添加劑。《GB2760-2014食品添加劑使用標準》中規定各種飲料中苯甲酸的最大使用量和限量，如碳酸飲料，最大使用量為0.2 g/kg；低鹽醬菜、醬類、蜜餞，0.5 g/kg；葡萄酒、果酒、軟糖，0.8 g/kg；醬油、食醋、果醬（不包括罐頭）、果汁（味）型飲料，1.0 g/kg；食品工業用塑料桶裝濃縮果蔬汁，2.0 g/kg；果汁（果味）冰，1.0 g/kg（混用或單獨使用）[1]。由于添加劑的不合理使用，當前飲品中苯甲酸含量超標使用的 常

苯用甲方 酸法超有高標效檢液測相是色飲譜品法監（管H的PL一C）部[2]分、氣，目相前色檢譜測法（法G（C H）P[3]L、C氣-相M色S）譜[5]、質毛譜細法管（電G泳C-法M[6S]、）紫[4]外、液分相光色光譜度質法譜[7]以食及品薄安層全層國析家法標[8]準等。食在品國中家苯標甲準酸中、，《山G梨B酸50和09糖.28精-鈉20的16測方定法》前中處采理用繁的瑣也、是耗液時相長色，儀譜器法操和作氣需相要色專譜業法技，這術些人員，難以現場快速檢測。現象經常發生，對消費者的生命健康造成傷害。

針對上述問題，本項目根據免疫分析原理，建立飲品中苯甲酸免疫分析技術，研制酶聯免疫分析試劑盒，以滿足企業與基層單位對液態奶中苯甲酸鈉殘留作現場檢測和批量檢測的需求，為飲品中苯甲酸的現場快速檢測提供了技術支撐，具有科學價值和重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白(OVA)（阿拉丁生化科技股份有限公司）；對氨基苯甲酸、、碳酸鉀、尿素、亞硝酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸（杭州米克化工儀器有限公司）；辣根過氧化物酶標記抗兔（IgG)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（上海佑隆生物科技有限公司）。

緩沖液 PBS（0.01 mol/L,pH 7.4)：磷酸二氫鉀0.27 g，磷酸氫二鈉1.42 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，加去離子水約800 mL充分攪拌溶解，加入濃鹽酸調p H至7.4，定容到1 L。

封閉液：0.2%脫脂奶粉的PBS溶液。

底物緩沖液(p H 5.0磷酸-檸檬酸緩沖液)：0.2 mol/L磷酸氫二鈉(28.4 g/L)25.7 mL，0.1 mol/L檸檬酸(19.2 g/L)24.3 mL，加蒸餾水至100 mL。

TMB（3,3’5,5’-四甲基聯苯胺二鹽酸）底物使用液：TMB(10mg/5mL無水乙醇)0.5 mL，底物緩沖液(pH O.5）10mL，30%H H2SO410μL。(臨用時新鮮配制，H2SO4在臨用前加入，配后立即使用）

終止液（2 mol/L H2SO4）：取蒸餾水177.8 mL，逐滴加入98%濃硫酸22.2 mL。

1.2 儀器

酶標儀（賽默飛世爾科技公司）、恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、磁力攪拌儀（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），全波長紫外分光光度儀（上海元析儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫抗原和包被抗原的制備

取800 mg對氨基苯甲酸,400 mg亞硝酸鈉溶于10 mL三蒸水中,置冰浴中攪拌20 min,加少量尿素得重氮鹽溶液。逐滴加入BSA溶液(500 mg BSA溶于25 mL PBS溶液中),避光攪拌48 h后將其置于透析袋中,4℃下用PBS液透析兩天,期間多次換液,至透析袋外液幾乎無色為止,取透析袋內容物,用PBS液調至50 mL,即為對氨基苯甲酸-BSA,分裝后冷凍干燥，置于-20℃冰箱中保存。反應方程式如下：

包被抗原制備方法同上，將BSA換為OVA即可。用紫外可見分光光度計鑒定。

1.3.2 抗體的制備

取2月齡雌性新西蘭大白兔兩只采用大腿肌肉多點注射的方式進行三次免疫。每次每只新西蘭大白兔抗原免疫用量為500μg，初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第三次用等量生理鹽水混合，耳靜脈注射。第二次免疫后14 d靜脈采血，通過間接法測抗體效價，以此確定是否有針對目標的抗體生成。效價達標后第三次進行加強免疫；效價不達標，則第三次繼續弗氏不完全佐劑皮下進行免疫，28 d后第四次進行加強免疫。加強免疫14 d后取血。血清離心取上清，經Protein-A柱進行純化，得到多克隆抗體，測定效價、親和常數和特異性。

1.3.3 ELISA試劑盒的研制

根據棋盤稀釋法用PBS稀釋包被原（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μg等）和抗體（1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000等），在酶標板上加入包被原120μL/孔，4℃過夜，棄去溶液，PBS沖洗3次；加入封閉液150μL/孔，37℃溫育1 h，棄去溶液，PBS沖洗3次；加入系列抗體溶液50μL/孔37℃溫育1 h，棄去溶液，PBS沖洗3次。加入酶標記抗IgG（1∶8000）100μL/孔37℃30 min，棄去溶液，PBS沖洗3次。再加底物TMB 100μL/孔,37℃溫育15 min后加50μL終止液終止反應。

1.3.4 試劑盒檢測限、精密度測定

在酶標儀上測定反應液吸光值（450 nm），取吸光值為1的組合作為最適包被濃度和抗體濃度。配制苯甲酸標準濃度系列，按ELISA測定吸光值，計算結合率，結合率對苯甲酸濃度的對數作曲線，得到苯甲酸酶聯免疫分析標準曲線，從而得出檢出限。利用ELISA檢測試劑盒測定牛奶、果汁和葡萄酒樣品，通過同一次測定中各平行樣本的變異系數(批內變異系數)和同一樣本在不同批次測定中的重復性(批間變異系數)反應試劑盒的重復性和穩定性。

1.3.5 前處理技術研究

取不同飲品樣品（乳品、乳酸飲料、果汁等），每份1 mL，按0.03、0.3、3μg/mL的比例添加標準苯甲酸溶液，每個樣品設3個重復，再添加等量的乙腈、水和甲醇，3 000 r/min條件下離心2 min，取上清進行檢測（本試驗得到的酶聯免疫試劑盒）。根據回收率結果得到適合的提取試劑和方法。

2 結果與分析

2.1 ELISA試劑盒

2.1.1 紫外可見分光光度計鑒定人工抗原

圖1、圖2說明BSA、對氨基苯甲酸、BSA蛋白與對氨基苯甲酸偶聯產物三者的紫外吸收光譜均有明顯的差異(OVA類同)。人工抗原對氨基苯甲酸-BSA、對氨基苯甲酸-OVA分別在236、223 nm處有明顯的出峰；對氨基苯甲酸在248 nm處有出峰；相對平緩；OVA在210 nm、279 nm處有出峰。三條曲線峰值有明顯的改變，說明人工抗原相對于對氨基苯甲酸和OVA在化學結構上發生了變化，證明對氨基苯甲酸成功地偶聯到證明載體蛋白上。

計算可得BSA蛋白和對氨基苯甲酸偶聯產物偶聯比25，蛋白質含量為178；OVA蛋白和對氨基苯甲酸偶聯產物偶聯比為73，蛋白質含量為140。即在該反應體系中和反應條件下，合成的人工抗原中，半抗原與載體BS的偶聯比率約為25∶1。

2.1.2 抗原效價測定

表1表明單克隆抗體效價達到1∶243 000。

2.1.3 抗體的親和常數計算

親和常數K=150 000/（滴度×抗體濃度）=150 000/[(1/243 000)×1]=3.645×1 010，由此計算結果可知抗體具有良好的親和性。

2.1.4 抗體的交叉反應

表2表明抗體的交叉反應率均較低，說明制備的抗體有良好的特異性。

圖1 BSA蛋白，對氨基苯甲酸及BSA蛋白與對氨基苯甲酸偶聯產物的紫外分光光譜

圖2 OVA蛋白，對氨基苯甲酸及OVA蛋白與對氨基苯甲酸偶聯產物的紫外分光光譜

2.1.5 苯甲酸抗體與包被原最佳工作濃度的確定

由表3中可以看出，當OD450在1.0左右時，抗原濃度為1.5μg/mL，抗體稀釋濃度為1.0μg/mL，以此作為本實驗抗原抗體的最佳工作濃度。

2.1.6 標準曲線及線性分析

由圖3可得，間接ELISA法分析線性方程為:y=-0.4787x+1.6904，苯甲酸在0.03～3 mg/L范圍內，結合率與苯甲酸濃度的對數值呈顯著的線性關系，相關系數R2=0.997，檢出限為0.027 mg/L。

2.1.7 ELISA試劑盒測樣的精密度測定

由表4的實驗結果可以看出，ELISA試劑盒的平均批內變異系數和批間變異系數均小于7.51%。

2.1.8 回收率及與GC的對比實驗

從表5可以看出，ELISA的平均回收率是93.29%，G 96C.2的1%平。均回收率是96.97%，這兩者的相符率在

2.1.9 ELISA試劑盒的組成

(1)包被苯甲酸包被原的96孔酶標板一塊；

表1 兔單克隆抗體效價測定

表2 抗體交叉率表

表3 苯甲酸抗體與包被原最佳工作濃度

圖3 間接ELISA測得的苯甲酸的標準曲線

表4 間接競爭ELISA試劑盒測樣的精密度

(2)苯甲酸抗體一瓶；

(3)抗體稀釋液一瓶；

(4)洗滌液一瓶；

(5)辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG一瓶；

(6)酶標二抗稀釋液一瓶；

(7)底物及顯色液各一瓶；

(8)終止液一瓶。

2.2 前處理技術

從表6中可知，利用甲醇對不同飲品樣品中的苯甲酸進行提取，離心過濾后，取上清進行檢測，有較高的回收率。

因此，前處理方法為取5 mL飲品樣品，加入等量甲醇溶液，3 000 r/min條件下離心2 min，取上清進行檢測。

表5 樣品中添加苯甲酸的回收率與GC對比實驗

表6 以牛奶為例研究不同溶劑對苯甲酸的回收率的影響

3 討 論

的檢

目前我國苯甲酸超標使用現象仍時有發生，傳統的檢測方法有高效液相色譜法[9-11]氣相色譜法[12-13]及其聯用質譜法[14-15]等。王克新等[16]利用高效液相色譜法測定乳制品中的苯甲酸和山梨酸含量，其中苯甲酸的最低檢出量為1.5×>10-9g，回收率為99.93%，變異系數為0.22%。舒平等[15]以固相微萃取-氣相色譜質譜聯用法(SPME-GC/MS)分析測定原料乳中苯甲酸，檢出限和定量限分別為0.2mg/L和0.5mg/L，平均回收率為83.2%～97.9%。雖然這類方法的靈敏度較高，結果穩定，但是樣品的預處理操作較為繁瑣，測定周期長，但是所需儀器較為昂貴。以免疫化學為基礎ELISA檢測試劑盒屬于超微量分析技術[17-18]，主要是以抗原或抗體的固相化及其酶標記為基礎，具有快速、靈敏經濟、簡便的特點，適合大批量樣品篩查，但國內外鮮有用于檢測乳制品中苯甲酸含量的研究報道。因此，研制乳飲料中苯甲酸的快速檢測試劑盒，對方便現場快速檢測和維護人們食品健康具有重要的科學價值和研究意義。

本研究根據免疫分析原理和苯甲酸的結構特點，選擇對氨基苯甲酸作為偶聯物，既突出了以苯甲酸整個結構作為特異結構，可提高特異性，有具備合適的偶聯臂，能得到抗體。以對氨基苯甲酸為半抗原成功合成了免疫抗原和包被抗原，同時針對飲品中苯甲酸的檢測作了系統性的探討，建立了用于檢測飲品中苯甲酸的免疫分析技術，酶聯免疫分析試劑盒的檢測限分別為0.027 mg/L，本法所用的抗體與其他參與實驗的結構類似物沒有反應，說明具有較高的特異性。對加標試樣的回收率均符合技術要求，批間批內變異系數均較低。該種方法都具有快速、簡便、特異、安全等特點，試劑盒可在3 h內完成實驗，且準確性較高，為飲品中苯甲酸的現場快速檢測提供了技術支撐，具有科學價值和重要意義。可以預見，該試劑盒在飲品中苯甲酸含量的現場檢測和批量檢測中有廣闊的應用前景。

4 結論

本研究基于免疫分析原理，通過合成苯甲酸免疫原和包被原，制備抗體，優化包被原濃度和抗體稀釋度，研制酶聯免疫分析試劑盒，用于乳飲料中苯甲酸含量的快速檢測。該試劑盒檢測限為0.027 mg/L，與現有檢測方法相比，該試劑盒具有樣品前處理簡單、靈敏、快速等優點，適合基層單位和中小企業對乳飲料中苯甲酸的含量作現場檢測和批量檢測。