去甲斑蝥素通過Wnt/β-catenin信號通路誘導乳腺癌細胞MCF-7凋亡

殷世亮，張弘，賈麗娜，金戈，房麗娜，孟冉，吳祖倩，周雪茹，王露桐

（1.沈陽醫學院基礎醫學院藥理學教研室，遼寧 沈陽110034；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院；3.沈陽藥科大學藥學院）

去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）為芫青科昆蟲南方大斑蝥或黃黑小斑鰲中有效成分斑蟊素的去1，2位甲基人工合成化合物，在臨床上常被作為抗癌藥物使用。臨床研究結果表明NCTD對肝癌、食管癌及胃癌的發生、發展均有較強的治療作用［1］，然而其對乳腺癌的治療作用及其作用機制還尚不明確，亟待進一步闡明。已有研究表明Wnt/β-catenin通路的激活在乳腺癌的無限增殖、自我更新、黏附和遷移侵襲過程中發揮了至關重要的作用［2］。Wnt/β-catenin通路的激活可導致磷酸化β-catenin去磷酸化，從而使游離的β-catenin在胞漿中蓄積并進入細胞核，進而與Tcf/Lef家族 蛋 白（T cell factor/Lymphoid enhancer factor）形成轉錄復合物，啟動下游靶基因包括MMP-7的轉錄，進而調控抗凋亡、細胞自我更新、遷移侵襲等細胞程序，導致癌癥的發生與發展［3-6］。因此，本研究將考察NCTD對乳腺癌細胞MCF-7的凋亡誘導作用，并進一步考察其對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響，以期明確NCTD對乳腺癌細胞的抗癌作用機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞系MCF-7（美國ATCC公司）；DMEM培養液（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；MTT（美國Sigma公司）；AnnexinV-FITC凋亡試劑盒（美國BioVision公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（美國Sigma公司）；β-catenin抗體、磷酸化β-catenin抗體、MMP-7抗體、β-actin抗體（美國Cell-signalling公司）；化學增強發光試劑盒（英國Amersham Biosciences公司）。去甲斑蝥素注射液由沈陽藥科大學藥劑教研室唐星教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人乳腺癌細胞株MCF-7接種在含有10%胎牛血清和105U/L青霉素及100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，在37℃，5%CO2培養箱內飽和濕度條件下培養。

1.2.2 MTT法行細胞成活率的測定 取對數生長期的MCF-7細胞（1×105/ml）接種于96孔培養板中，每孔100μl。加入不同濃度的NCTD（1 000、500、250、125、62.5、31.3、0μmol/L）孵育72 h后，加入MTT溶液（2.5 mg/ml），繼續孵育4 h后吸去上清，加入100μl二甲基亞砜，輕柔振蕩5 min后，使用酶標儀于492 nm處測定吸光度。利用下列公式求得細胞的成活率：給藥組細胞吸光度的平均值/空白組細胞吸光度的平均值×100%，并計算半數有效濃度（IC50）。

1.2.3 細胞PI染色的流式細胞術檢測NCTD對MCF-7細胞周期的影響 取對數生長期的MCF-7細胞（1×105/ml），接種于6孔培養板中，每孔5 ml。經不同濃度NCTD（0、50、100μmol/L）處理72 h后，離心后收集106個細胞，經70%冰冷的酒精固定過夜。然后收集樣品，于1 mg/ml的RNase溶液中37℃孵育30 min后，加入相應體積的PI試劑至終濃度為50μg/ml。在4℃條件下避光染色30 min后，將細胞過200目細胞過濾網。然后利用流式細胞儀（Becton Dickinson）對樣品DNA含量進行檢測，PI激發波長為488 nm，吸收波長為625 nm，定量計數10 000個細胞，數據采用CELLQuest軟件（Becton Dickinson）進行分析處理。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測NCTD對MCF-7細胞的凋亡誘導作用 取對數生長期的MCF-7細胞（1×105/ml）接種于6孔培養板中，每孔5 ml。加入不同濃度的NCTD（0、50、100μmol/L）孵育72 h后，每份樣品按照試劑盒說明書平均分為4份，使用相同量的緩沖液重懸，第1份為空白對照，第2份加入Annexin V-FITC 5μl，第3份加入PI 5μl，第4份加入FITC和PI各5μl。室溫下避光孵育5 min，使用400目細胞過濾網過濾，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot法檢測NCTD對MCF-7細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響 取對數生長期的MCF-7細胞（1×105/ml）接種于75 ml細胞培養瓶中，每瓶10 ml。加入不同濃度的NCTD（0、25、50、100μmol/L）孵育72 h后，收集細胞。細胞內的蛋白樣品（45μg蛋白）通過RIPA裂解緩沖液（50 mmol/L Tris鹽酸、150 mmol/L氯化鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L PMSF、100μmol/L leupeptin和2μg/ml aprotinin，pH 8.0）裂解得到。Bradford方法定量蛋白后，利用非連續SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將裂解得到的蛋白樣品進行分離，再通過電轉移裝置將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。用0.2%麗春紅染色液對膜染色以確定各孔道的蛋白是否等量上樣并是否成功轉移至膜上。5%的脫脂奶粉對膜封閉后，將一抗用1%的脫脂奶粉1∶1 000稀釋。隨后將硝酸纖維素膜孵育待測蛋白的特異性抗體，于4℃過夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，隨后將二抗用1%的脫脂奶粉1∶2 000稀釋，室溫孵育硝酸纖維素膜1 h。用TBST洗膜3次，每次10 min，隨后在暗室中在硝酸纖維素膜上含有蛋白的一面滴加免疫印跡化學發光試劑（ECL kit，Amersham Biosciences）后，蛋白條帶可經X光片（放射自顯影片）感光記錄。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，采用單因素方差分析及Dunnett-t檢驗進行數據分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NCTD可顯著降低MCF-7細胞的成活率 MTT結果顯示，NCTD作用于MCF-7細胞72 h后，其在1 000、500、250、125、62.5μmol/L濃度下均可顯著降低MCF-7細胞的成活率（P＜0.01），其IC50值為（100.73±3.17）μmol/L。見圖1。

2.2 NCTD對MCF-7細胞周期的影響 PI染色的流式細胞術結果顯示，與空白對照組處于G0/G1期細胞百分比［（72.59±1.09）%］比較，50、100 μmol/L NCTD組細胞G0/G1期分布情況分別為（55.23±2.40）%、（39.74±6.61）%，差異均有統計學意義（P＜0.01）；50與100μmol/L NCTD組處于G0/G1期細胞百分比比較差異亦有統計學意義（P＜0.01），呈濃度依賴性。與空白對照組處于G2/M期細胞百分比［（5.67±0.71）%］比較，50、100 μmol/L NCTD組細胞G2/M期分布情況分別為（15.69±1.06）%、（33.07±2.21）%，差異均有統計學意義（P＜0.01）；50與100μmol/L NCTD組細胞G2/M期分布情況比較差異亦有統計學意義（P＜0.01），呈濃度依賴性。見圖2。

圖1 NCTD對MCF-7細胞成活率產生的影響

圖2 NCTD對MCF-7細胞周期（G0/G1期和G2/M）分布情況的影響

2.3 NCTD對MCF-7細胞凋亡百分比的影響 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術結果顯示，與對照組的早期凋亡率［（5.87±0.41）%］比較，NCTD作用72 h后，50μmol/L NCTD組的早期凋亡率為（10.77±3.03）%，差異無統計學意義（P＞0.05）；100μmol/L NCTD組的凋亡率為（15.10±3.63）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組的晚期凋亡率（2.48±0.99）%比較，NCTD作用72 h后，50 μmol/L NCTD組的晚期凋亡率為（6.21±4.53）%，差異無統計學意義（P＞0.05）；100μmol/L NCTD組的凋亡率為（12.44±3.21）%，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 NCTD對MCF-7細胞的凋亡誘導作用

2.4 NCTD對Wnt信號通路相關蛋白的影響Western blot法結果顯示，NCTD可顯著降低MCF-7細胞中β-catenin的蛋白表達水平，升高磷酸化βcatenin的蛋白表達水平。濃度分別為0、25、50、100μmol/L的NCTD作用72 h后，MCF-7細胞中磷酸化β-catenin/β-catenin的蛋白表達量比值分別為0.041、0.198、0.777和0.973；NCTD還可顯著降低β-catenin下游蛋白MMP-7的蛋白表達水平。見圖4。

3 討論

NCTD是我國首先合成的抗癌藥物，其在臨床上常被用于治療消化道腫瘤。多年臨床研究結果表明NCTD對消化道腫瘤如肝癌、食管癌、胃癌的療效良好［7-8］，本研究首先采用MTT法考察了NCTD對乳腺癌細胞系MCF-7細胞成活率的影響。研究結果表明，與對照組相比，濃度為62.5、125、250、500、1 000μmol/L的NCTD作用72 h，均可顯著降低乳腺癌細胞MCF-7的細胞成活率，且呈濃度依賴性。其IC50值為（100.73±3.17）μmol/L，即NCTD可濃度依賴地降低乳腺癌MCF-7細胞的成活率。

圖4 NCTD對MCF-7細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的影響

隨后細胞周期測定以及AnnexinV-PI雙染的實驗結果表明，NCTD可顯著降低MCF-7細胞的G0/G1期細胞百分比，升高MCF-7細胞的G2/M期細胞百分比，且呈濃度依賴性。且AnnexinV/PI雙染流式細胞術的研究結果表明，100μmol/L NCTD可顯著升高MCF-7細胞的早期凋亡和晚期凋亡百分比，這表明NCTD降低MCF-7細胞成活率的機制可能是通過誘導MCF-7細胞發生凋亡。

已有研究表明，Wnt/β-catenin通路的激活在乳腺癌細胞的自我更新、遷移侵襲過程中發揮了至關重要的作用［9-12］。尤其是β-catenin，在整個事件中起到一個核心的作用。Wnt/β-catenin通路的激活可抑制GSK-3β的對β-catenin的磷酸化作用。Wnt/β-catenin通路激活所導致的胞漿中磷酸化β-catenin/β-catenin比值減低極有可能是導致乳腺癌細胞抗凋亡、干細胞自我更新以及遷移侵襲的罪魁禍首，這同時也說明β-catenin具有成為抗乳腺癌治療靶點的潛力——如果降低胞漿內β-catenin的濃度，升高磷酸化β-catenin的濃度就有可能誘導乳腺癌干細胞發生凋亡。

本研究Western blot結果表明NCTD可升高MCF-7細胞中磷酸化β-catenin的蛋白水平，并降低游離β-catenin的蛋白表達水平，顯著升高了磷酸化β-catenin/β-catenin的蛋白表達比值。這表明NCTD作用后，游離β-catenin在MCF-7細胞中的蓄積明顯降低。Western blot結果也進一步證實，NCTD作用后β-catenin蛋白的下游通路蛋白MMP-7的蛋白表達水平也有所下降。因此本研究結果提示，NCTD可能通過Wnt/β-catenin通路誘導MCF-7細胞發生凋亡。