蕪湖市1例輸入性重癥惡性瘧的實驗診斷與分析

陳潛，王波，劉淦，盧瑩，周貝貝，曹玉祥，柳發虎，楊進孫，孫恩濤*

（1.皖南醫學院檢驗學院，安徽 蕪湖241002；2.皖南醫學院弋磯山醫院檢驗科；3.皖南醫學院弋磯山醫院感染性疾病科）

瘧疾是重要的蚊媒傳染病。WHO數據顯示2017年在全球瘧疾病例中惡性瘧病例最多，且99.7%發生在非洲國家［1］。安徽省自2014年起，全省發現的瘧疾病例均為境外輸入性病例［2］。目前，以PCR為基礎的分子生物學檢驗技術因其特異靈敏、準確快速成為了實驗室診斷的首選方法［3］。治療瘧疾的藥物主要有氯喹、青蒿素、乙胺嘧啶等。氯喹作為一線抗瘧藥曾大面積使用甚至濫用，其耐藥現象越來越嚴重［4］。目前臨床治療瘧疾以青蒿素聯合療法為主，但近年來發現的惡性瘧原蟲對青蒿素的耐藥現象也受到了越來越廣泛的關注［5］。對于耐藥位點的檢測，Awasthi等［6］的研究結果表明只要氯喹耐藥基因—氯喹抗性轉運蛋白（P fcrt）發生錯義突變，惡性瘧原蟲即對氯喹耐藥。Takala-Harrison等［7］和Ariey等［8］的研究發現惡性瘧原蟲的青蒿素耐藥基因—K13發生突變即表現為青蒿素抗性。因此，早期確定瘧疾類型、及時檢測耐藥位點對有效控制瘧疾的流行、拯救患者生命至關重要。本研究采用巢式PCR檢測了皖南醫學院弋磯山醫院收住的1例輸入性重癥瘧疾患者的相關指標，并對患者耐藥基因突變情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 病例資料 患者，男，65歲，安徽省南陵縣人，工人，在非洲尼日利亞居住4月余。于2018年8月3日不慎摔倒后因出現意識模糊、大小便失禁遂被送往皖南醫學院弋磯山醫院就診，無肢體抽搐。實驗室檢查：白細胞9.8×109/L，中性粒細胞78.9%，紅細胞2.35×1012/L，血紅蛋白72 g/L，血小板22×109/L；瘧原蟲鏡檢：陽性；急診八項、胸部CT未見明顯異常。

1.2 研究方法

1.2.1 血涂片鏡檢 采集患者外周血制成厚、薄血涂片。干燥、固定后，用瑞氏染液染色，油鏡下觀察血涂片，并鑒定瘧原蟲種類。

1.2.2 瘧原蟲核酸檢測 采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取患者基因組DNA。參照文獻［9］的反應程序和體系進行巢氏PCR擴增，引物序列見表1。引物序列的合成及擴增陽性片段測序工作均交由上海生工科技有限公司完成。

表1 惡性瘧巢式PCR引物序列

1.2.3 耐藥基因檢測 參照文獻［10］的方法擴增氯喹耐藥基因Pfcrt，文獻［11］的方法擴增青蒿素耐藥基因K13，耐藥基因巢式PCR引物序列見表2。引物序列的合成及擴增陽性片段測序工作均交由上海生工科技有限公司完成。

表2 耐藥基因巢式PCR引物序列

1.2.4 基因克隆測序分析 將2種耐藥基因的PCR擴增產物經純化回收后進行克隆，陽性單克隆菌液送往上海生工科技有限公司測序，測序結果于NCBI上比對分析。

2 結果

2.1 鏡檢結果 鏡下可見厚血膜中紅細胞堆疊，蟲體皺縮；薄血膜中被寄生的紅細胞形狀規則，大小正?；蚵钥s小。瘧原蟲環狀體典型，較纖細，直徑約為紅細胞直徑的1/5，有的位于紅細胞邊緣，有的在環內出現一個大的空泡。部分紅細胞內環狀體可見兩個細胞核，與惡性瘧原蟲形態相似，見圖1。

2.2 惡性瘧巢氏PCR擴增結果 取第2輪惡性瘧特異性PCR產物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為200 bp，見圖2。

陽性產物測序結果通過NCBI上BLAST比對，相似率為100%，證實為惡性瘧原蟲，與形態鑒定一致。

2.3 耐藥基因擴增結果 取氯喹耐藥基因Pfcrt巢式PCR第二輪產物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為140 bp；青蒿素耐藥基因K13巢式PCR第二輪產物進行電泳，擴增條帶長度與目的條帶相近，約為750 bp。見圖3。

圖1 血涂片鏡檢結果（瑞氏染色×1 000）

圖2 惡性瘧巢式PCR檢測結果

圖3 耐藥基因巢式PCR檢測結果

上述兩種陽性產物經克隆測序結果通過NCBI上BLAST比對，相似率為100%，證實Pf crt基因和K13基因均未發生突變。

3 討論

近年來，隨著全球人口流動和貿易往來的不斷加快和深入，往返非洲和東南亞等瘧疾高發地區的人員越來越多，如何有效防治輸入性瘧疾感染是當今面臨的新問題?！?018年世界瘧疾報告》指出，在全球所有瘧疾病例中，尼日利亞、剛果、莫桑比克、印度、烏干達等5個國家占近一半，其中以尼日利亞（25%）最多［1］。我國近年來感染的輸入性瘧疾病例主要為惡性瘧和間日瘧［12-13］。本研究患者即為尼日利亞輸入性惡性瘧感染。安徽省作為勞務輸出大省，則更應該重視輸入性瘧疾的診斷和控制。

本例患者外周血涂片中未發現配子體，這與惡性瘧外周血中少見配子體相一致［14］。瘧原蟲環狀體纖細，約為紅細胞直徑的1/5；胞內可含2個以上原蟲，蟲體位于紅細胞邊緣，符合惡性瘧原蟲的特征。鏡檢雖然作為瘧原蟲診斷的“金標準”，但其操作過程較長，受采血時間、制片染色等人為因素影響較大，在瘧原蟲密度較低時可能漏檢［15］，導致報告結果呈假陰性［16］。而且，血涂片鏡檢在卵形瘧、三日瘧和混合感染的診斷時準確率較低［17-18］?？焖贆z測試劑條（rapid diagnostic test，RDT）檢測方法的準確性、特異性均較高，可大范圍篩查，簡便快捷，經濟投入也較少，但是其對瘧原蟲分型準確度欠缺，結果可信度一般，還需要其他方法的進一步驗證，只適合定性篩查，不適合定型，偶見假陰性［19］。因此，及時敏感的診斷方法對臨床患者的治療至關重要。有研究表明，PCR技術在瘧原蟲密度低至0.2個/μl以下時即可檢測，而且在鑒別蟲種和混合感染時也有顯著效果［20］。周水茂等［21］研究也表明巢式PCR在診斷輸入性瘧疾病例時效果良好。本研究采用的方法即為巢式PCR，兩輪擴增使產物更精確，減少非特異性擴增的影響。該法敏感性和特異性均較高，在一般實驗室即可開展，但為了確保檢測結果的準確性和特異性，可以聯合鏡檢和PCR兩種方法進行檢測。

雖然瘧疾的控制取得了顯著的成效，但隨之出現的耐藥突變也不容忽視。研究發現，瘧原蟲對目前所有已知的單一抗瘧藥都產生了耐藥性［22］，WHO也強調了聯合用藥在瘧疾治療中的重要性。因此，本研究檢測了臨床上最主要的抗瘧藥氯喹和青蒿素的耐藥情況。Dittrich等［23］研究表明一旦Pfcrt基因exon2區72～76連鎖的5個編碼氨基酸其中一個發生錯義突變，惡性瘧原蟲即對氯喹產生耐藥性。同時，研究結果也表明，K13基因的突變與蟲株對青蒿素產生抗性密切相關，該分子作為青蒿素抗性相關的分子標記已被廣泛接受［24-26］。雖然本例患者氯喹耐藥基因P fcrt和青蒿素耐藥基因K13均未發生突變，但檢測的重要性卻不容忽視。通過對這些輸入性惡性瘧原蟲相關基因的檢測，可以早期預測瘧原蟲是否產生耐藥突變，從而指導臨床及時調整用藥方案，延長抗瘧藥的使用期限，提高抗瘧藥的治療效果，這對我國2020年全國消除瘧疾目標的實現具有重要意義。