耐亞胺培南銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶的檢測及其耐藥性分析

張雪松

[摘要] 目的 探討該院耐亞胺培南銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶的檢測方法，并了解該地區耐亞胺培南銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶的耐藥特征，為該院對銅綠假單胞菌的控制提供依據。方法 方便選取65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，對其進行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗。采用E-test試驗對金屬酶進行檢測，采用PCR法擴增產金屬β-內酰胺酶的基因，并進一步測序確認擴增的陽性產物。結果 65株銅綠假單胞菌的標本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），在分布上呼吸內科、ICU病房比較高，分別占了總數的33.85%（22株）和36.92%（24株）。藥敏試驗結果顯示，有18株（27.69%）銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥，并且大多為多重耐藥菌株;E-test試驗結果顯示，陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%;PCR法擴增金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株。結論 該地區耐亞胺培南的18株銅綠假單胞菌中大多為多重耐藥菌株，產金屬β-內酰胺酶在銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥中發揮著極其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2為酶的主要基因型。

[關鍵詞] 亞胺培南;銅綠假單胞菌;產金屬β-內酰胺酶;耐藥性;基因型;藥敏試驗;PCR法

[中圖分類號] R378.99? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）09（c）-0178-03

[Abstract] Objective To investigate the detection method of metallo-β-lactamase produced by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the hospital， and to understand the metallo-β-lactamase production by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in the region. The drug resistance characteristics provide a basis for the control of Pseudomonas aeruginosa in the hospital. Methods A total of 65 specimens of patients hospitalized in the hospital from July 2017 to December 2018 were conveniently selected. 65 strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated and identified for their strains and drug sensitivity tests. The metalloenzyme was detected by the E-test test， and the gene for producing metal β-lactamase was amplified by PCR， and further amplified to confirm the positive product. Results Of the 65 strains of Pseudomonas aeruginosa， the respiratory secretions were the most， accounting for 81.54% （53 strains）. The distribution of upper respiratory medicine and ICU wards was relatively high， accounting for 33.85% （22 strains） and 36.92% （24 strains）. The results of drug susceptibility test showed that 18 strains （27.69%） of Pseudomonas aeruginosa were resistant to imipenem， and most of them were multi-drug resistant strains; E-test test results showed that 4 positive metalloenzymes， detection rate was 22.22%; 3 strains （4.62%） were positive for metalloenzyme gene by PCR， among which IMP-1 and VIM-2 were 3 strains and 1 strain， respectively. Conclusion Most of the 18 strains of Pseudomonas aeruginosa resistant to imipenem in the region are multi-drug resistant strains. The production of metal β-lactamase plays an important role in the resistance of Pseudomonas aeruginosa to imipenem. The role of IMP-1 and VIM-2 is the major genotype of the enzyme.

[Key words] Imipenem; Pseudomonas aeruginosa; Metallo-producing β-lactamase; Drug resistance; Genotype; Drug sensitivity test; PCR method

銅綠假單胞菌（PA）是一種導致院內感染的重要條件致病菌，其會引發菌血癥、腦膜炎、院內肺炎、術后傷口感染、泌尿系統感染等病癥[1]。而多重耐藥的PA由于其耐藥范圍比較廣，并且能夠對多種抗生素表現出耐藥性，但是臨床上對于治療受到PA感染患者的有效藥物卻比較少。近年來，隨著臨床上抗生素的廣泛使用，細菌對亞胺培南等藥物的耐藥率也呈現出了逐年上升的趨勢[2]。有研究人員在研究中發現，PA對亞胺培南的耐藥率在逐漸下降，而導致PA對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制比較多，如碳青霉烯酶的產生、ESBLs等，而因為產金屬β-內酰胺酶（MBLs）導致PA對抗生素耐藥的情況也在逐年增加[3]。由于MBLs具有整合子的傳播性，隨時都可引起MBLs院內感染事件的爆發和流行[4]。該次方便收集了65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，對其進行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗，并對耐亞胺培南的PA進行了MBLs檢測和耐藥性分析，進一步了解了該院內亞胺培南耐藥PA的特點以及其產生金屬酶的情況。現報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便選取65例在該院住院治療的患者的標本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌菌株。

1.2? 菌株鑒定以及藥敏試驗

對其進行菌種的鑒定和藥物的敏感試驗。采用哥倫比亞瓊脂以及相關的鑒定卡片對該次收集到的65株分離菌種進行鑒定。然后采用MH瓊脂以及相應的抗生素紙片對65株菌株進行藥敏試驗。該次試驗中判斷亞胺培南和美洛培南敏感性的標準為：當最低抑菌濃度≤4 μg/mL時判斷為敏感，當最低抑菌濃度=8 μg/mL時判斷為中介，當最低抑菌濃度≥16 μg/mL時判斷為耐藥[5]。該次試驗均按照相關的標準要求進行規范化操作，最后對藥敏試驗的結果進行判讀。

1.3? E-test試驗

采用E-test試驗對金屬酶進行檢測，取鑷子將拭條夾起放在涂布為0.5麥氏單位的亞胺培南耐藥菌懸液的瓊脂表面上，放在溫度為36 ℃的環境下孵育18～24 h，對其結果進行觀察。以E-test試驗說明書中的相關標準為依據對其結果進行判定：當MIC比值>8時，也就是當EDTA/亞胺培南的MIC下降值≥8倍時，判斷為菌株產金屬酶[6]。

1.4? PCR擴增試驗對MBLs基因型別進行檢測

采用核酸提取盒對65株PA的DNA進行提取，設計出檢測MBLs編碼基因的PCR產物以及相應的反應條件，進行PCR擴增試驗。將其送往該市基因科技公司對PA的IMP基因和VIM基因進行測序確認。

2? 結果

2.1? PA在該次分離標本中的構成比

65株銅綠假單胞菌的標本中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），其次為膿液7株，占比10.77%，傷口分泌物3株，占比4.62%，其他2株，占比3.08%。

2.2? PA在該院科室中的分布

在分布上呼吸內科、ICU病房比較高，在分布上呼吸內科、ICU病房比較高，分別占了總數的33.85%（22株）和36.92%（24株），其次為急診、胸外科和骨科。

2.3? PA臨床分離菌株對12種藥物的耐藥率

65株PA對阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、環丙沙星、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、氨曲南、亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為：41.54%、49.23%、50.77%、32.31%、23.07%、36.92%、64.62%、49.23%、24.62%、29.23%，對多粘菌素的敏感率為50.77%。藥敏試驗結果顯示，有18株（27.69%）銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥，并且有16株（88.89%）為多重耐藥菌株。這些菌株對氨基糖苷類、頭孢類、氟喹諾酮類、碳青霉烯類、含有酶抑制劑的β-內酰胺類等抗菌藥物中的3類或者3類以上耐藥。18株多重耐藥菌株中有8株（44.44%）為廣泛耐藥菌株，其對除哌拉西林以外的其余11類常用藥物的耐藥率均為100.00%。18株耐亞胺培南PA的耐藥情況比較嚴重，對臨床上12種常用藥物中的11種藥物的耐藥率均超過50.00%。見表1。

2.4? 亞胺培南耐藥組與敏感組金屬酶表型和基因型的檢測

65株PA經E-test試驗，結果顯示，18株亞胺培南耐藥組中檢出陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%，47株亞胺培南敏感菌株中未檢出金屬酶陽性菌株。檢出率為0.00%。PCR法擴增金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株，其他幾種基因型的β-內酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未檢出。

3? 討論

該次研究中收集了65例2017年7月—2018年12月在該院住院治療的患者的標本，臨床分離了65株銅綠假單胞菌，其中以呼吸道分泌物最多，占比81.54%（53株），分布在上呼吸內科、ICU病房的菌株分別為22株（33.85%）和24株（36.92%）。萬強等人[7]在研究中，選取了臨床分離的400株銅綠假單胞菌，對其進行菌種鑒定和藥物敏感試驗，結果顯示，400株銅綠假單胞菌中，呼吸道分泌物最多，占比81.50%（326株），分布在上呼吸內科、ICU病房的菌株分別為79株（19.8%）和102株（25.5%）。該次研究結果與萬強等人[7]的研究結果是一致的，進一步提示院內呼吸內科和ICU是PA感染的高發區域[8]。對其進行分析后發現，這可能是由于ICU患者免疫力比較低，呼吸內科患者的痰液不容易被排出，增加了患者誤吸的幾率，同時，呼吸內科患者呼吸機等器械的頻繁使用均增加了呼吸道感染的幾率[9]。

β-內酰胺類抗菌藥物臨床應用比較廣泛，其包括β-內酰胺類、青霉素類、頭孢類、碳青霉烯類等[10]。該次分離的65株PA對哌拉西林、亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為23.07%、24.26%和29.23%，因此發現，在該院β-內酰胺類抗菌藥物依然是臨床治療PA重癥感染患者的首選藥物。但是由于臨床上對抗生素的不合理使用，導致PA對亞胺培南的耐藥率逐漸升高，并且對耐亞胺培南PA菌株的檢出率也在逐漸升高，這也給臨床治療帶來了較大的困難[11]。該次藥敏試驗結果顯示，有18株銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥，并且大多為多重耐藥菌株。提示PA能夠對抗廣泛的耐藥種類，并且其耐藥水平還比較高。E-test試驗結果顯示，18株亞胺培南耐藥組中檢出陽性金屬酶4株，檢出率為22.22%，47株亞胺培南敏感菌株中未檢出金屬酶陽性菌株。檢出率為0.00%。該次研究中針對上述基因設計的引物進行了PCR擴增后結果發現，金屬酶基因陽性3株（4.62%），其中IMP-1和VIM-2分別為3株和1株。而其他幾種基因型的β-內酰胺酶（如SPM、GIM、SIM、AIM、KHM、DIM、NDM）均未檢出，這與Samaneh Shirazi等人[12]的研究結果是一致的。

綜上所述，產金屬β-內酰胺酶所引起的細菌感染事件的增加和流行敲響了警鐘，臨床上應加強對抗菌藥物的規范使用。該院耐亞胺培南的18株銅綠假單胞菌中大多為多重耐藥菌株，產金屬β-內酰胺酶在銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥中發揮著極其重要的作用，并且IMP-1和VIM-2為酶的主要基因型。臨床上應加強對PA耐藥性的監測，并加強預防為主，避免長期使用同一種類型的抗菌藥物，同時還應加強對病原學的檢查，根據藥物敏感試驗的結果選擇正確的抗菌藥物，以達到最佳的治療效果，并做好院內感染的預防和控制。

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（收稿日期：2019-06-28）