智三針電針改善血管性癡呆大鼠認知功能及機制

朱世 唐中生 胡雪梅 魏宇唯 林吉

(1貴州中醫藥大學解剖教研室，貴州 貴陽 550025；2貴州中醫藥大學研究生院)

血管性癡呆(VD)是老年人常見的癡呆類型之一，嚴重損害中老年人的健康，在早期階段有效防治VD具有重大的社會意義〔1〕。在哺乳動物神經系統發育過程中，Eph受體及其配體ephrin在突觸特異性連接的建立過程及可塑性的調節等方面都有重要作用〔2〕，進而影響到大腦的學習與記憶功能〔3〕。智三針電針療法對VD有積極的預防和治療作用。本文通過研究Eph/ephrin對突觸棘形態結構可塑性的調控，探討智三針電針對VD大鼠學習記憶改善的主要機制，為臨床電針治療VD提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重300～320 g，由第二軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)2012-0011。

1.2器材 手術器械1套，華佗牌針灸針(0.3 mm×40 mm，蘇州醫療用品廠)。石蠟組織包埋機(德國Lica公司，EG1140)；石蠟組織切片機(德國Lica公司，RM2145)；BX51型光學顯微鏡(日本Olympus)；高速冷凍離心機(湘儀貝克)；Morris水迷宮(江蘇賽昂斯公司)；微型動脈夾、加熱式單極電凝針(杭州康生醫療)等。

1.3藥品與試劑 戊巴比妥鈉(P3761，Sigma)；尼莫地平片(亞寶藥業公司，國藥準字H14022821)；4%多聚甲醛，蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒(賽默飛，貨號23246)、一步法快速Western印跡試劑盒(兔、鼠)、ECL發光檢測試劑盒、β-actin抗鼠單克隆抗體(北京康為世紀)；ephrinB3、EphA4、ephrinA3、EphB2(博奧森)，干擾素(IFN)-γ、C1q試劑盒(Elabscience)。組織包埋盒(江蘇世泰實驗器材公司，31050102W)。

1.4分組 將動物隨機分為假手術組、VD 模型組、尼莫地平組和電針組，剔除造模過程中死亡的大鼠，保證每組12 只。

1.5動物模型的建立 采用改良四血管阻斷法(4-VO)模擬大鼠VD模型〔4，5〕。采用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔麻醉，電凝針灼燒凝閉雙側椎動脈，動脈夾反復夾閉頸總動脈〔5，6〕。將造模成功的大鼠按照前期課題組的設計隨機分為VD 模型組、電針組和尼莫地平組。設置假手術組作為陰性對照，排除手術對實驗的干擾，該組不進行血管的灼閉和夾閉。術后各組腹腔注射青霉素預防感染。

1.6治療方法 術后7 d，待傷口完全愈合、飲食正常，給予相應治療。電針及尼莫地平組每天治療1 次，7 d為1個療程，共治療3個療程，療程之間休息1 d。電針組，術后第7天開始治療。采用特制的固定器固定大鼠頭部及四肢，保持其清醒狀態下，定位大鼠的本神穴及神庭穴〔6〕，施以60 Hz的連續波，電針治療20 min。尼莫地平組，根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”確定大鼠灌胃藥量，按12 mg/(kg·d)的用量、3 mg/ml的濃度配制，進行灌胃治療。

1.7Morris水迷宮檢測行為認知功能 治療結束后開始水迷宮測試。第1～6天進行路線學習實驗，以迷宮四周的標志為參照物，引導大鼠記憶入水點到平臺的路線，如在2 min內未找到平臺，引導大鼠站在平臺上記憶參照物及路線，記錄找到平臺所用時間，如未在規定時間內找到平臺，時間記為120 s。第7天進行路線記憶實驗：記錄2 min內大鼠在平臺所在象限搜索平臺所用的時間百分比。

1.8腦組織HE染色〔7〕采用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，先后灌注生理鹽水和多聚甲醛〔5〕，灌注結束后置于4%多聚甲醛中固定。取大鼠海馬CA1區，HE染色，光鏡下觀察腦組織細胞變化。

1.9血漿炎癥因子測定 用3%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，股動脈取血，3 000 r/min離心20 min取上清，按照試劑盒說明書檢測IFN-γ、C1q含量。

1.10Western印跡檢測 稱取大鼠海馬腦組織，盡可能剪碎，先將蛋白抽提試劑進行預冷，加入蛋白酶抑制劑、組織蛋白抽提試劑，冰浴勻漿及超聲破碎；離心收集上清；30%Acr-Bis分離膠緩沖液，10%APS TEMED混勻，制備10%分離膠，上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，20 mA恒流電泳，待預染Marker條帶分離清晰、間距適宜時，停止電泳。200 mA恒流，低溫轉膜2 h。轉膜結束，使用一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀鼠CW2030，兔CW2029)，加入封閉液中，20 min；另取二抗HRP至4 ml離心管中，再取一抗與二抗混勻，室溫孵育5 min，加入一步法抗體稀釋液。在反應盒內加入高靈敏度化學發光檢測試劑盒A液及B液各1 ml，混勻，放入聚偏氟乙烯(PVDF)膜，掃面膠片，定量分析。

1.11統計學方法 采用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1各組空間學習能力比較 隨著訓練引導天數增加，VD模型組尋找平臺所用時間比假手術組明顯延長(P<0.05)，證明VD模型組的學習能力低于假手術組，造模有效。電針組和尼莫地平組尋找平臺所用時間比VD模型組明顯縮短(P<0.05)，證明智三針電針和尼莫地平都能提高血VD大鼠學習能力。電針組與尼莫地平組比較差異無統計學意義(P>0.05)

2.2各組空間記憶能力比較 第7天，VD模型組平臺象限搜索的時間百分比明顯低于假手術組，說明VD組記憶能力下降；電針組和尼莫地平組搜索平臺象限概率顯著高于模型組，說明電針治療和尼莫地平都能提高VD大鼠的空間記憶能力，但電針組與尼莫地平組比較搜索時間百分比及搜索次數差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組海馬CA1區組織形態學觀察 HE染色后，低倍鏡下假手術組大鼠海馬CA1區神經元細胞排列整密無缺失；VD模型組神經細胞各層界限不十分清晰，細胞出現缺失現象。高倍鏡下，假手術組星形細胞和錐體細胞形態較為清楚，細胞帶排列基本致密完整；VD模型組細胞排列無序雜亂，核固縮深染，多數細胞溶解壞死，未見細胞帶；電針組和尼莫地平組較VD模型組變性壞死細胞明顯減少。提示與假手術組相比，VD模型組海馬區病變損傷程度最嚴重，而電針組病變損傷程度明顯減輕，說明電針智三針處理對VD大鼠海馬區缺血性損傷有較好的改善作用，尼莫地平組與電針組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.4針刺能改善VD大鼠大腦炎癥反應 VD組血清IFN-γ和C1q含量均明顯高于假手術組，電針組血清IFN-γ和C1q含量明顯小于VD模型組。提示造模后的大鼠腦缺血會產生全身性的炎癥反應，而智三針電針治療可以減輕VD大鼠腦缺血后的炎癥反應。電針組與尼莫地平組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 各組大鼠海馬CA1區病理改變(HE)

表1 各組血清IFN-γ和C1q含量比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與VD模型組比較：2)P<0.05；與尼莫地平組比較：3)P<0.05；下表同

2.5Eph/ephrin信號通路調控突觸可塑性 與假手術組比較，VD模型組海馬區突觸膜表面EphB2和ephrinB3的表達明顯提高(P<0.05)；與VD模型組比較，電針組海馬區突觸膜表面EphB2和ephrinB3的表達明顯提高(P<0.05)。尼莫地平組與電針組比較無統計學差異(P>0.05)。見圖2，表2。

圖2 各組腦組織海馬區EphB2、ephrinB3表達

組別EphB2ephrinB3假手術組0.147±0.0180.212±0.021VD模型組0.052±0.0191)0.120±0.0211)尼莫地平組0.352±0.0231)2)0.377±0.0311)2)電針組0.383±0.0031)2)3)0.358±0.1061)2)3)

3 討 論

腦血管疾病嚴重威脅著人類的健康，尤其是缺血性腦血管病發病率逐年增高。VD是目前癡呆和腦缺血領域研究的一個熱點。“智三針”為“靳三針”之一，是我國針灸大師靳瑞獨創的治療老年性癡呆、VD、健忘等有關智力與記憶方面疾病的經典組穴，在臨床上取得了良好的治療效果〔8〕。智三針所取三穴，為神庭穴與兩側的本神穴。本實驗采用的4-VO模擬的VD大鼠模型，實際上是大腦的缺血再灌注模型〔9〕。大鼠大腦缺血再灌注的過程導致了海馬區神經元壞死和凋亡，進而導致大鼠的學習和記憶能力低下。同時缺血再灌注過程會產生大量的炎癥因子和補體人血〔10〕。血中的炎癥因子和補體相關因子會加重缺血后的腦組織損傷〔11〕。本實驗結果證實炎癥反應參與了腦缺血繼發性損傷的過程。證明智三針電針治療減輕了腦缺血后的炎癥反應和再灌注對腦組織的損傷。

突觸前膜的EphB2和突觸后膜的ephrin B3之間的相互作用抑制了MAPK信號，使效應蛋白的生物學效應降低，從而影響突觸功能的可塑性〔12，13〕。活化的EphB2能夠黏著斑激酶(FAK)與細胞骨架相關蛋白Rho A活化，進而調控樹突棘形態結構的可塑性〔14，15〕。本研究提示智三針電針和尼莫地平均能調節突觸功能的可塑性，提高樹突棘的形成和促進突觸功能的成熟，有利于改善VD大鼠的學習和記憶能力。造模后大鼠的學習記憶能力顯著下降，伴隨大腦缺血缺氧及海馬區大量神經元細胞凋亡；智三針電針改善了大腦缺血、海馬神經元細胞凋亡和腦缺血再灌注后的炎癥反應，提高了大鼠學習及記憶能力，其機制可能是通過調節突觸前膜EphB2和突觸后膜ephrinB3表達，降低血清IFN-γ和補體Gq表達來實現。