LanCL1過表達(dá)對氧糖剝奪誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及Sirt3-PGC-1α通路的影響

王御林 高元杰 鐘純正 王生成 王曉峰

(儋州市人民醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，海南 儋州 571700；2呼吸內(nèi)科)

缺氧缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的50%以上，腦部缺血缺氧易造成神經(jīng)功能損傷引發(fā)腦卒中，是導(dǎo)致患者死亡和神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因之一〔1〕。目前缺血性腦損傷的病理機(jī)制尚不完全清除，已證實(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡是缺血性腦損傷的主要表現(xiàn)形式，對腦損傷范圍及患者神經(jīng)功能預(yù)后起決定性作用〔2,3〕。因此，研究神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制對臨床治療腦缺血性疾病具有重要意義。研究表明，人源硫化雙丙氨酸環(huán)化酶樣蛋白(LanCL)1在腦神經(jīng)元中表達(dá)，受神經(jīng)元活動誘導(dǎo)，是響應(yīng)氧化應(yīng)激并減輕神經(jīng)元損傷所必需的元素，對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用〔4〕。本研究以神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞為研究對象，模擬氧糖剝奪(OGD)模式，分析OGD條件下PC12細(xì)胞中LanCL1的表達(dá)變化，探討過表達(dá)LanCL1對PC12凋亡的影響及其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的可能作用途徑。

1 材料與方法

1.1材料 PC12未分化細(xì)胞購于豐暉生物，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清和青霉素、鏈霉素購于美國Hyclone公司，磷脂結(jié)合蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物，pcDNA3.1載體及pcDNA3.1-LanCL1合成于武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)合成試劑盒和實(shí)時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購于美國Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，沉默調(diào)節(jié)蛋白(Sirt)3抗體一抗、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(PGC)-1α抗體一抗、LanCL1抗體、辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗購于武漢艾美捷科技有限公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，VeritiTMPCR儀(美國Thermo Scientific公司)，7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(德國Binder公司)，Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞置于含有5%胎牛血清、10%馬血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，放于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后進(jìn)行傳代，取細(xì)胞密度5×105個/ml接種，每2～3 d換液一次，待細(xì)胞密度至(2～4)×106個/ml時進(jìn)行第2次傳代。使用神經(jīng)生長因子(NGF)50 ng/ml處理第2代對數(shù)生長期細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞分化。

1.3細(xì)胞分組 將細(xì)胞分為4組，對照組為正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞；OGD組將PC12細(xì)胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；pcDNA3.1組為將pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞(轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明書進(jìn)行)，并將細(xì)胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；pcLanCL1組為將pcDNA3.1-LanCL1轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞，并將細(xì)胞接種于無血清DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h后，轉(zhuǎn)入加血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4RT-PCR檢測LanCL1 mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑分別提取對照組和OGD組培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h細(xì)胞總RNA，使用cDNA合成試劑盒合成cDNA，稀釋cDNA為統(tǒng)一濃度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，RT-PCR檢測LanCL1 mRNA相對表達(dá)量，RT-PCR體系參照定量RT-PCR試劑盒，模板量為1 μl，程序：95℃ 2 min；95℃ 1 min；55℃ 2 min，共40個循環(huán)。LanCL1引物序列：正向5′-CCTTCAGGTGAACCAAGGAA-3′，反向5′-AGATCACGTCAGCACACTGC-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′，反向5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′。同時檢測pcDNA3.1組和pcLanCL1組細(xì)胞培養(yǎng)24 h時LanCL1 mRNA相對表達(dá)量，相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.5MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生存率 收集各組細(xì)胞，以1×104個/孔接種于96孔板，按每組的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光培養(yǎng)4 h。倒掉培養(yǎng)基，每孔加入200 μl DMSO，震蕩混勻1 min，在酶標(biāo)儀上測定570 nm處吸光度。

1.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1次，離心棄PBS后，加入PBS重懸細(xì)胞，過濾，棄PBS。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Annexin V和PI染色液，避光染色30 min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7Western印跡檢測LanCL1、Sirt3和PGC-1α蛋白表達(dá) 收集1.3中各組培養(yǎng)6、12、24、48 h后的細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的條帶后，轉(zhuǎn)至纖維素膜(轉(zhuǎn)膜過程中帶上干凈的無菌手套，避免污染及損壞薄膜)，封閉2 h后，分別加入稀釋過的LanCL1抗體、Sirt3抗體和PGC-1α抗體一抗，4℃過夜孵育，然后加入稀釋的辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔二抗，繼續(xù)孵育2 h，抗體稀釋比例參照說明書。加入顯色劑顯色后，放入Kodak數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并采用Image J軟件分析目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LanCL1在OGD PC12細(xì)胞中表達(dá)降低 與對照組PC12細(xì)胞相比，OGD組PC12細(xì)胞中LanCL1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于對照組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 兩組各時間點(diǎn)PC12細(xì)胞中LanCL1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平

與對照組比較，1)P<0.05

圖1 兩組PC12細(xì)胞中LanCL1蛋白表達(dá)

2.2LanCL1過表達(dá)促進(jìn)OGD PC12細(xì)胞存活 對照組、OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組LanCL1 mRNA相對表達(dá)量分別是1.86±0.41、0.79±0.24、0.70±0.17、1.81±0.39，pcLanCL1組細(xì)胞中LanCL1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。OGD組和pcDNA3.1組細(xì)胞存活率〔(45.38±9.42)%、(44.46±10.83)%〕顯著低于對照組〔(95.67±17.23)%，P<0.05〕；pcLanCL1組細(xì)胞存活率〔(88.94±15.27)%〕較OGD組和pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明過表達(dá)LanCL1促進(jìn)OGD條件下PC12細(xì)胞生存。

2.3LanCL1過表達(dá)抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡 OGD組、pcDNA3.1組和pcLanCL1組細(xì)胞凋亡率〔(46.83±10.74)%、(45.33±9.86)%、(21.19±3.68)%〕均顯著高于對照組〔(13.37±2.51)%,P<0.05〕，pcDNA3.1組細(xì)胞凋亡率與OGD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，pcLanCL1組細(xì)胞凋亡率顯著低于OGD組(P<0.05)，說明LanCL1過表達(dá)抑制OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡

2.4LanCL1過表達(dá)促進(jìn)OGD PC12細(xì)胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達(dá) OGD組和pcDNA3.1組細(xì)胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均顯著低于對照組(P<0.05)；pcLanCL1組細(xì)胞中Sirt3、PGC-1α蛋白相對表達(dá)量均顯著高于OGD組和pcDNA3.1組(P<0.05)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明LanCL1過表達(dá)能夠促進(jìn)OGD PC12細(xì)胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達(dá)。見圖3，表2。

1～4：對照組、OGD組、pcDNA3.1組、pcLanCL1組圖3 各組細(xì)胞中Sirt3、PGC-1α蛋白表達(dá)水平

組別Sirt3PGC-1α對照組1.24±0.391.19±0.28OGD組0.62±0.251)2)0.61±0.231)2)pcDNA3.1組0.61±0.221)2)0.59±0.181)2)pcLanCL1組1.08±0.351.03±0.32

與對照組比較：1)P<0.05；與pcLanCL1組比較，2)P<0.05

3 討 論

近年來，雖然腦缺血缺氧引起的腦卒中死亡率有所下降，但腦卒中仍是全球人類死亡和殘疾的主要原因〔5〕。目前，組織型纖溶酶原激活劑是唯一獲得食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的用于治療急性缺血性腦卒中的治療藥物，因此神經(jīng)保護(hù)藥物的研發(fā)和應(yīng)用對腦卒中患者具有重要意義。LanCL1是LanC樣蛋白家族成員，以往研究證實(shí)LanCL1能特異性結(jié)合還原型谷胱甘肽(GSH)，參與氧化還原調(diào)節(jié)〔6〕。近年來動物模型實(shí)驗(yàn)表明，LanCL1蛋白在腦、脊髓中高表達(dá)，表現(xiàn)出受神經(jīng)元活動調(diào)節(jié)，并且在神經(jīng)元抗氧化活性中起關(guān)鍵作用〔7〕。本研究說明LanCL1在神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)中起作用。此外，本研究還通過檢測Sirt3-PGC-1α通路闡述了LanCL1保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的可能潛在機(jī)制。

Sirt3是NAD+依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，主要定位在線粒體，是線粒體功能調(diào)節(jié)因子，在抗細(xì)胞凋亡和抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用〔8,9〕。研究報(bào)道，Sirt3在衰老、神經(jīng)退行性疾病和抗逆性中可以預(yù)防神經(jīng)紊亂，起到神經(jīng)保護(hù)作用，且Sirt3的激活可以介導(dǎo)各種保護(hù)劑對腦卒中的有益作用〔10,11〕。本研究與Xie等〔12〕研究結(jié)果相似。Sirt3抑制細(xì)胞凋亡的作用主要有：①可直接調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔關(guān)閉，抑制促凋亡蛋白釋放而降低細(xì)胞凋亡率〔13〕；②Sirt3也可通過清除氧自由基抑制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡〔14〕；③通過抑制c-Jun氨基末端激酶的磷酸化或通過去乙?；疨53激活抗凋亡途徑而抑制細(xì)胞凋亡〔15〕。提示過表達(dá)LanCL1可能通過誘導(dǎo)Sirt3表達(dá)升高降低OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡。

PGC-1α是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，在調(diào)節(jié)大腦等線粒體生物合成和能量代謝中起關(guān)鍵作用〔16,17〕。Wang等〔18〕研究表明，敲除Sirt3加劇OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷，而過表達(dá)Sirt3可以保護(hù)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡，其保護(hù)作用依賴于PGC-1α和錳超氧化物歧化酶。研究報(bào)道，PGC-1α-Sirt3途徑可通過直接去乙酰化和三磷酸腺苷(ATP)中的ATP合酶β來預(yù)防神經(jīng)元細(xì)胞凋亡〔19,20〕。本研究提示LanCL1對保護(hù)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用可能與PGC-1α-Sirt3途徑密切相關(guān)，過表達(dá)LanCL1能夠通過Sirt3-PGC-1α信號途徑保護(hù)OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

本研究初步分析LanCL1在OGD條件下PC12細(xì)胞中的表達(dá)作用及其可能作用機(jī)制，后期將會繼續(xù)驗(yàn)證其神經(jīng)元保護(hù)作用，為臨床治療腦缺血缺氧性疾病提供理論參考和新的治療靶點(diǎn)。