早期恐懼聲音應激對大鼠遠期學習記憶能力及海馬CA1區5-HT1AR-CREB-BDNF信號通路的影響

孫縵利 鄧海峰 王興紅

(漯河醫學高等專科學校，河南 漯河 462000)

心理應激是機體在某種環境刺激作用下由于客觀要求和應付能力不平衡而發生的心理生理功能改變的過程。心理應激的產生可提高機體的警覺水平，應付各種環境變化的挑戰，但長時間的應激狀態則會損害心身健康〔1〕，兒童的心理狀態處于不穩定的易變期，早期創傷性心理應激事件(如母愛剝奪、家庭變異、受虐、恐怖影像、自然災害等)對成年后的認知能力、學習記憶、精神狀態等往往有較深遠的影響〔2〕。更好地了解童年期心理創傷及創傷后應激障礙的相關問題，有助于進一步認識心理創傷帶來的影響，理智對待創傷后應激障礙。研究報道，心理應激能夠損傷動物空間學習和記憶能力〔3〕；另有研究表明，5-羥色胺1A受體(HT1AR)-環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)-腦源性神經營養因子(BDNF)信號通路和動物的認知情況密切相關〔4〕。本研究擬探討嬰幼兒期心理應激與成年后學習記憶的關系及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 兔抗鼠5-HT1AR、CREB和BDNF多克隆抗體均購自Abcam公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒均購自碧云天生物技術公司；Morris水迷宮裝置由中國醫學科學院藥物研究所研制。

1.2實驗動物及分組 10只健康SD孕鼠，清潔級，體質量(230±10)g，購于河南省實驗動物中心(動物合格證編號：SCXK豫 2014-0002)，所有動物在自然光暗周期的環境中飼養，自由覓食、飲水。10只孕鼠隨機分為對照組和應激組各5只，待其生產后每組各選擇20只雄性仔鼠進行實驗研究。參照Hu等〔5〕的方法，應激組的雄性仔鼠于出生后第1天開始接受恐懼聲音應激，強度為65～85 dB，每天上、下午各播放2 h，應激后放回原籠置于正常環境下飼養，應激持續21 d。對照組雄性仔鼠出生后于正常環境下飼養。兩組仔鼠均于出生后第21天斷乳，然后自由進食、飲水。應激結束后5 w行Morris水迷宮實驗檢測學習記憶能力。

1.3Morris水迷宮實驗檢測學習記憶能力 Morris水迷宮水池中加入適量的墨汁，使水池成為不透明色(去除視覺干擾)。在圓桶的上緣等距離地設東、南、西、北4個標記點作為進水點，以這4個入水點在水面和水桶底部的投影點將水面和水桶部分均等地分為4個象限。將平臺放置于第3象限的中間，水溫保持在22～23℃。

1.3.1大鼠訓練 訓練時，將大鼠面向池壁從4個入水點分別放入水池，記錄從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需時間，作為潛伏期。找到平臺后，讓其在平臺上站立60 s。若入水后120 s未能找到平臺，則將其輕輕從水中拖上平臺，并停留10 s，然后進行下一次訓練。每只大鼠從4個入水點分別放入水池為一次訓練，兩次訓練之間間隔30 s，用紙巾將其擦干凈。

1.3.2定位航行試驗 觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間，即記錄其潛伏期，歷時4 d，上下午各訓練4次(各個象限)，記錄其潛伏期，上臺后休息60 s，繼續下一個象限訓練。用于測量對水迷宮學習和記憶的獲取能力。

1.3.3空間搜索試驗 定位航行試驗結束后去除平臺，從同一個入水點放入水中，測其第一次到達原平臺位置的時間、120 s內穿環次數。用于測量學會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。

1.4HE染色觀察海馬CA1區的病理情況 Morris水迷宮實驗結束后，每組隨機選取4只大鼠，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，打開胸腔，0.9%生理鹽水做心臟灌流5 min，然后4%多聚甲醛灌流固定約10 min，斷頭取出腦組織，4%多聚甲醛中室溫固定至少6 h，酒精梯度脫水(各10 min)，二甲苯透明和石蠟包埋，冠狀面切片，切片厚度為5 μm，烤片，貼片，HE染色2～3 min，酒精脫水，再經二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察病理學變化。

1.5免疫熒光組織化學法檢測海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達 每組各取8只大鼠，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經4%多聚甲醛心臟灌流，用徠卡冰凍切片機對灌流固定好的組織進行冠狀面切片，厚度為30 μm。所得切片置于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次。用0.3% Triton X-100破膜處理2 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，10%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h，加入一抗(兔多克隆抗體5-HT1AR，1∶500；兔多克隆抗體CREB，1∶300；兔多克隆抗體BDNF，1∶500)4℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，用FITC標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育2 h，0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次，90%甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。每只大鼠隨機選取5張非連續切片，采用Image pro plus6.0圖像處理軟件測定其積分光密度值(IOD)。

1.6Western印跡法檢測海馬5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達 每組各取8只，0.8%戊巴比妥鈉麻醉，經4%多聚甲醛心臟灌流，快速取出全腦，冰浴分離出海馬，按1 g∶10 ml的比例加入全細胞裂解液，組織經勻漿、超聲破碎后，用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉硝酸纖維素(NC)膜，10%脫脂牛奶封閉NC膜1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，然后室溫下與兔抗鼠一抗5-HT1AR(1∶1 000)、CREB(1∶1 000)、BDNF(1∶1 000)雜交反應2 h，TBST漂洗同前，再將NC膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG(1∶3 000)雜交反應1 h，TBST漂洗同前，加入電化學發光試劑反應5 min，保鮮膜包裹，暗室進行X線膠片曝光、顯影和定影。然后同一張NC膜再與β-肌動蛋白(actin)(1∶1 000)進行雜交反應。Western印跡條帶經凝膠成像分析系統掃描處理，計算單位光密度值和條帶面積，將各實驗點的總光密度值與對照組比較，得到相對百分數。

1.7統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1學習記憶能力檢測結果 與對照組相比，應激組大鼠逃避潛伏期和第1次到達原平臺位置的時間明顯延長(P<0.001)，穿環次數明顯減少(P<0.001)。見表1。

2.2海馬CA1區HE染色結果 對照組海馬區神經元結構整齊、排列緊密，而應激組海馬區的神經元排列疏松紊亂，并且出現了神經元丟失。見圖1。

2.3兩組海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達比較 被標記上綠色或黃色的為陽性細胞。

免疫熒光組化結果表明，對照組海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白陽性表達較多，染色較強，而應激組海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白陽性表達明顯減少(P<0.001)，染色較弱。見圖2，表2。與對照組相比，應激組海馬CA1區的5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達均明顯降低(P<0.001)，見表2，圖3。

表1 各組水迷宮、跳臺實驗結果比較

圖1 兩組海馬CA1區的形態(HE染色，×400)

圖2 兩組海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達(HE染色，×400)

組別免疫熒光組織化學(IOD)5-HT1ARCREBBDNFWestern印跡5-HT1AR/β-actinCREB/β-actinBDNF/β-actin對照組0.62±0.030.43±0.020.75±0.050.99±0.221.08±0.260.93±0.20應激組0.47±0.020.28±0.010.61±0.030.42±0.150.31±0.130.40±0.14t/P值11.770/<0.00118.970/<0.0016.791/<0.0016.119/<0.0017.492/<0.0016.140/<0.001

圖3 兩組海馬5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白的表達

3 討 論

心理應激動物模型的造模方法常見的有足底電機、睡眠剝奪、強迫游泳等，但這些造模方法大都包括軀體應激和心理應激兩種影響因素。以大鼠恐懼的聲音為應激源對其持續應激所建立的恐懼聲音應激模型是一種簡單易行、較為純粹的心理應激模型。Morris水迷宮是檢測動物學習記憶能力的一種經典方法，而對學習記憶能力的檢測是對心理應激水平評估的一項重要指標〔6〕。嬰幼兒期是神經發育最迅速的時期，此時各種應激極易導致神經可塑性變化，從而影響后期的認知發展和運動功能〔7〕。本研究結果顯示，早期恐懼聲音應激可以降低其成年后的學習記憶能力，這與之前報道一致〔8〕。提示對恐懼聲音應激模型的處理是成功的。

海馬是學習記憶發生、改變的關鍵腦區，應激時海馬尤其是CA1區結構極易受損而發生可塑性變化，從而影響學習記憶功能〔9〕。本實驗表明早期恐懼聲音應激可以導致海馬CA1區形態結構發生病理學改變。5-HT是中樞神經系統中與學習和記憶密切相關的遞質，其作用是通過5-HT受體中介〔10〕，可以調節突觸遞質釋放、改變突觸傳遞效率、調控神經損傷后修復能力。5-HT受體有很多亞型，其中5-HT1AR集中于大腦皮質及邊緣葉等與記憶功能密切相關的腦區，其活性與人類的認知功能息息相關，是介導5-HT系統發揮其調控神經功能的重要受體〔11〕。研究報道，增強海馬5-HT1AR介導的神經信息傳遞，可提高海馬功能和抵御應激性損傷的能力〔12〕。由此分析早期恐懼聲音應激導致的海馬CA1區病理學改變可能和5-HT1AR活性有關。5-HT1AR并非直接影響學習記憶能力，其表達發生變化后，引起下游分子發生相應變化，才能進一步影響突觸可塑性，最終影響學習記憶〔13〕。

CREB是一種重要的參與學習記憶功能的核轉錄因子，也是5-HT1AR介導的信號通路下游的重要分子之一〔14〕。5-HT1AR通過G蛋白耦聯調控cAMP酶活性，進而調控CREB活性。CREB活性受到抑制后會引發中樞內多種神經營養因子的表達下降，從而降低突觸可塑性、抑制長時程增強(LTP)〔15〕。本研究提示CREB表達下調可能參與了早期恐懼聲音應激導致的學習記憶能力降低。

BDNF是一種重要的神經營養因子，廣泛地表達于大腦皮層、海馬、下丘腦等中樞神經系統，參與神經元的分化、發育和神經元損傷后的修復與再生，同時其表達下調可降低突觸傳遞效率和突觸可塑性〔16〕。本實驗提示BDNF表達下調可能參與了早期恐懼聲音應激導致的學習記憶能力降低。

基于以上研究報道和本次實驗結果，分析早期恐懼聲音應激導致大鼠成年后的學習記憶能力下降可能和海馬CA1區5-HT1AR、CREB和BDNF蛋白表達變化有關，其機制可能是早期恐懼聲音應激首先導致海馬CA1區5-HT1AR表達下降，進而通過抑制cAMP酶活性下調CREB表達，CREB表達下調進一步使BDNF表達降低，由于BDNF表達降低可導致突觸傳遞效率下降，產生長時程抑制效應，最終引發學習記憶障礙，但具體機制還需深入探究。

綜上，早期恐懼聲音應激可能通過下調5-HT1AR-CREB-BDNF信號通路，使大鼠學習記憶能力下降。即嬰幼兒期遭受過度心理應激可影響成年后的認知能力，因此為了保護嬰幼兒健康身心發展，除了采取措施避免其遭受過度應激外，還要在其遭受應激后盡早采取措施以預防更嚴重的后果出現。