雙氫青蒿素和吉非替尼聯用對肺癌NCI-H1975細胞凋亡相關蛋白Bax與Bcl-2表達的影響

金紅 楊嵐 張黎 莫迪 李夢雨 武艷 季洪良 姜愛英

(牡丹江醫學院附屬紅旗醫院 1檢驗科，黑龍江 牡丹江 157011；2眼科;3科研科;牡丹江醫學院 4第一臨床醫學院;5醫藥研究中心；6牡丹江醫學院附屬紅旗醫院呼吸科)

目前肺癌已成為我國位居第一的癌癥殺手，也是男性居首位的癌癥死亡原因，女性第二位的癌癥死亡原因〔1，2〕。吉非替尼作為非小細胞肺癌治療的一線藥物，被廣泛應用于臨床，但由于耐藥導致治療受限，因此開發多靶點的靶向治療藥物來增強吉非替尼作用敏感性是目前研究的熱點。研究發現雙氫青蒿素(DHA)具有抗腫瘤活性〔2〕，本研究旨在探討DHA和吉非替尼聯用對肺癌NCI-H1975細胞凋亡相關蛋白Bax與Bcl-2表達的影響。

1 資料與方法

1.1一般材料 人肺腺癌NCI-H1975細胞株購自中科院，10%胎牛血清和CCK8檢測試劑盒購自中國海門碧云天生物技術研究所，Bcl-2 抗體、Bax抗體購自美國Abcam，吉非替尼和DHA購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2藥物處理 DHA以二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為1×10-1mol/L儲存液(DMSO濃度≤1‰)，-20℃避光保存。吉非替尼10 mg，置100 ml量瓶中，用DMSO溶解并稀釋濃度為100 μg/ml，-4℃保存。

1.3實驗分組 對照組、吉非替尼組、DHA組、DHA+吉非替尼聯合用藥(聯合)組。

1.4細胞培養與接種 NCI-H1975細胞復蘇后，待細胞生長到一定數量后，0.25% 胰酶消化，用含10%血清的DMEM培養基重懸細胞。計數以后調整細胞濃度為5×105個/ml，按每孔0.1 ml接種于96孔板上，37℃、5%CO2條件進行培養。

1.5用CCK8法檢測細胞增殖 取生長狀態良好的對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化，計數，將細胞以密度為5×105個/ml接種于96孔培養板中，然后加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，在37℃培養箱中培養24 h，待細胞貼壁生長并達80%時，完全培養基稀釋吉非替尼和DHA分別至5個不同濃度，交叉組合作用24 h，向每孔加入20 μl CCK8溶液，將培養板在培養箱內繼續孵育1～4 h，在420 nm波長下用酶標儀測定每個樣本的吸光度(OD)值，每個樣品重復做3次。細胞存活率=OD用藥組/OD對照組×100%。對DHA與吉非替尼單獨和聯合給藥的原始數據按照聯合指數(CI)法進行分析，采用CalcuSyn軟件計算聯合用藥的CI。

1.6TUNEL染色法檢測細胞凋亡 細胞用4%多聚甲醛在室溫下固定30～60 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用含0.1% Triton X-100的枸櫞酸鈉緩沖液浸透，冰浴孵育2 min，PBS洗滌2次，加入50 μl原位凋亡檢測試劑盒的TUNEL檢測液，細胞核用4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，于37℃下避光孵育60 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察，激發光波長450～500 nm，發射波長515～565 nm(綠色熒光)，熒光顯微鏡下計數細胞總數和TUNEL陽性細胞數，并計算細胞凋亡率(凋亡陽性細胞數/細胞總數)。

1.7流式細胞儀檢測細胞周期 NCI-H1975細胞被接種于6孔板上，用DHA和(或)吉非替尼藥物作用于細胞，37℃孵育24 h。細胞用PBS洗滌2～3次后，用70%乙醇固定后在4℃過夜，最后，細胞在室溫下用80 mg/ml胰核糖核酸酶處理，轉移至試管中，加入50 mg/ml碘化丙啶(PI)染色液，室溫避光染色30 min，加入緩沖液，將全部液體轉移至流式管中，然后用流式細胞儀分析細胞DNA含量。測定DNA含量后，可用流式細胞儀配備的分析軟件Coulter?Epics?XLTMFlow Cytometer對其進行自動分析，測定的細胞周期按照DNA量分為G0/G1期、S期及G2/M期，并統計細胞周期各個時相所占比例。

1.8蛋白印跡法檢測凋亡相關蛋白表達水平 將藥物處理后的細胞收集加入裂解液，各組提取的總蛋白樣品30～90 μg在10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，將蛋白質從凝膠轉印到硝酸纖維素膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉)，浸泡被轉印膜，室溫反應1 h，封閉轉印膜上的一些非特異性蛋白質的潛在結合位點，防止發生非特異性反應；轉移結束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡；然后用第一抗體在4℃孵育過夜(抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體抗β-actin抗體)，棄一抗，用0.01 mol/L包含0.5% Tween 20的PBS分別洗膜，10 min×3次，振蕩；加入熒光標記的二抗溶液，室溫下反應1 h，保持平緩搖動；棄二抗，用0.01 mol/L PBS洗膜，10 min×4次，振蕩。電化學發光(ECL)顯色：將膜浸于ECL發光液中，避光顯色3 min，將膜用濾紙吸干，以β-actin作為內參對照，用Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統進行掃描，分析目標條帶的灰度值。

1.9統計學分析 使用SPSS16.0統計軟件進行t檢驗、方差分析、χ2及Fisher檢驗。

2 結 果

2.1DHA和吉非替尼對NCI-H1975細胞聯合用藥的藥物濃度確定 0、5、10、20、50、100 μmol/L DHA作用于NCI-H1975細胞OD值分別為：2.81±0.54、2.54±0.36、2.34±0.41、1.87±0.21、0.89±0.04、0.32±0.02；0.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L吉非替尼作用于NCI-H1975細胞OD值分別為：3.01±0.51、2.89±0.42、2.49±0.28、2.02±0.14、1.54±0.08、0.31±0.05。DHA和吉非替尼單獨用藥均對人肺腺癌NCI-H1975細胞增殖有明顯抑制作用，并呈劑量-反應關系DHA(10 μmol/L)+吉非替尼(10 μmol/L)組OD值 (1.18±0.21)顯著低于對照組(2.81±0.78)、吉非替尼組(2.01±0.45)及DHA(5 μmol/L)+吉非替尼(5 μmol/L)組(1.98±0.51)。DHA(10 μmol/L)與吉非替尼(10 μmol/L)聯合應用于NCI-H1975細胞的CI值為0.64，說明二者聯合為協同效應。因此，采用10 μmol/L DHA作為聯合吉非替尼的藥物濃度作為后續實驗藥物濃度。見表1。

2.2DHA與吉非替尼聯合用藥對NCI-H1975細胞增殖的抑制作用 與對照組(2.81±0.78)比較，吉非替尼組(1.98±0.51)對NCI-H1975細胞增殖有明顯抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.01)；聯合用藥組(1.18±0.21)能增強對NCI-H1975細胞的抑制作用，且與吉非替尼組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3各組NCI-H1975細胞凋亡比較 對照組細胞核呈圓形，DAPI染色均勻，而吉非替尼組和聯合組細胞核不規則，染色不均勻及片段化。DHA組細胞凋亡率為(2.98±0.09)%。與對照組〔(2.15±0.12)%〕比較，吉非替尼組〔(20.15±3.21)%〕能明顯增加NCI-H1975細胞凋亡率(P<0.01)；與吉非替尼組相比，聯合組〔(35.41±5.23)%〕能明顯增加NCI-H1975細胞凋亡率(P<0.05)。見圖1。

表1 DHA與吉非替尼聯合應用對NCI-H1975細胞作用的CI值

圖1 各組NCI-H1975細胞凋亡結果(×100)

2.4各組NCI-H1975細胞周期分布比較 吉非替尼組和聯合組G0/G1期、G2/M期細胞所占比例差異有統計學意義(P<0.05)；各組S期細胞所占比例差異無統計學意義(P>0.05)；見圖2，表2。

圖2 DHA與吉非替尼對NCI-H1975細胞周期分布的影響

表2 各組NCI-H1975細胞周期分布比較

與對照組比較：1)P<0.01；與吉非替尼組比較：2)P<0.05；表3同

2.5DHA和吉非替尼對NCI-H1975細胞凋亡相關蛋白(Bax和Bcl-2)表達水平的影響 與吉非替尼單獨用藥組比較，聯合用藥組中Bax蛋白的表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)；Bax/Bcl-2的比值明顯升高，有顯著性統計學差異(P<0.05)。見圖3、表3。

1～4：對照組、DHA組、吉非替尼組、聯合組圖3 各組Bax 和 Bcl-2蛋白表達水平比較

表3 各組凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討 論

肺癌是我國發病率和死亡率較高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌是引起癌癥死亡的主要原因之一〔3〕。臨床上通過化療藥物之間的聯合作用來提高單藥作用的敏感性已成為治療癌癥的新策略，也將成為未來治療癌癥的發展趨勢。目前將吉非替尼與放療聯合或與其他化療藥物聯合治療肺癌，以期提高吉非替尼藥物的療效，尋求克服吉非替尼的耐藥性的研究還較少。DHA是青蒿素成分中有效的代謝物，是一種被廣泛用于抗瘧疾的治療藥劑〔4～6〕，已有研究發現DHA在多種腫瘤細胞中均具有抗癌作用，能減少腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡〔7～9〕，同時對正常細胞具有較低毒性而成為一種新型的抗腫瘤藥物。有研究報道其他化療藥物與吉非替尼聯合應用能增強吉非替尼的敏感性，使藥效增強〔10，11〕。薛斌〔12〕研究發現，一定濃度的DHA能夠對瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡起促進作用，促進凋亡的作用與Bcl-2和survivin下調有關，最終通過含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(caspase)-9和caspase-3的活化而實現。

在惡性腫瘤發展過程中，不僅是細胞增殖失控和分化異常的結果，且與凋亡的抑制密切相關。存在于惡性腫瘤中的自發凋亡可能是引起腫瘤消退的一種自身治療腫瘤的作用。細胞凋亡可以被腫瘤的放療、化療和生物治療等各種刺激所誘導，是機體對各種刺激起到的一種自身保護和調節作用。腫瘤是細胞增殖和死亡異常引起的疾病，細胞凋亡對維持正常生理功能起到重要作用，隨著對腫瘤細胞凋亡機制的不斷深入研究發現，細胞凋亡過程受基因調控，Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡中起重要作用的一類蛋白質〔12〕。Bcl-2 蛋白是Bcl-2家族中最具有代表性的抑制凋亡基因，通過抑制蛋白酶的激活所需的適配器促進細胞生存，Bcl-2的升高可以提高各種類型的細胞生存和促進癌癥進展，且Bax蛋白對Bcl-2蛋白活性具有調控作用，是Bcl-2家族中最具代表性的促進凋亡的基因，腫瘤的放療、化療及生物治療作用主要通過Bax和Bcl-2對腫瘤細胞凋亡的調控作用〔13〕，二者形成了細胞凋亡的正負調控，二者比例決定了細胞是否凋亡，比例增高抑制細胞凋亡，比例降低則促進細胞凋亡。本實驗結果證實，相較于吉非替尼單獨用藥，DHA與吉非替尼聯合用藥能增強誘導NCI-H1975細胞凋亡作用；能更明顯地上調NCI-H1975細胞的Bax蛋白表達水平，使NCI-H1975細胞Bax/Bcl-2比值升高。

本研究首次研究DHA增強人肺腺癌細胞對吉非替尼的敏感性，但其中的作用機制是一個復雜、多因素、多層次、多條信號通路共同參與的相互作用的抗癌過程，其研究仍處于基礎階段。