噴氣燃料中微生物污染及檢測方法概述

牛明明 熊 云 孫新楓

摘 ?????要：微生物污染會降低燃料品質、影響燃料供給系統正常工作、增加燃料腐蝕性，是影響燃料儲存和飛機飛行安全的重要因素。從噴氣燃料中的特征微生物、微生物污染的危害和噴氣燃料中微生物檢測方法三個方面綜述了近幾年噴氣燃料中微生物污染問題研究進展，分析了目前仍然存在的問題，提出了下步研究的重點方向。

關 ?鍵 ?詞：噴氣燃料;微生物污染;危害;檢測方法

中圖分類號：TE626 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）02-0410-05

Abstract： Microbial contamination is an important factor affecting fuel storage and aircraft flight safety， because the microbial contamination can reduce the quality of fuel， affect the normal operation of the fuel system and increase the fuel corrosiveness. Based on the overview from three aspects， including the characteristic microbes in jet fuel， the hazards of microbiological contamination and the detection methods for microbes in jet fuels， existed problems of the detection methods were analyzed， and some advice on the next research was put forward.

Key words： Jet fuel; Microbial contamination; Problems; Detection methods

據統計，50%的航空發動機故障是由燃料的潔凈性不良引起的[1]。微生物是影響燃料潔凈性的一個重要因素[2，3]，對噴氣燃料的儲存和飛機飛行安全有重大影響。自1930年以來，人們逐漸認識到燃料中微生物生長繁殖所帶來的一系列危害，噴氣燃料的微生物污染問題開始受到關注[4]。1996年，微生物污染導致我國某機場數十臺發動機燃油泵堵塞，造成發動機燃油系統故障，更換發動機兩月后，同樣的故障依然出現，導致機場所有飛機停飛[5];2007年，國航西南公司的A340飛機油量傳感器故障，疑為微生物污染引起[6]。依據IATA的指導意見，從2009年下半年開始，我國對北京、天津、上海虹橋和廣州四個機場油料公司，進行微生物污染監控，確實發現了微生物污染問題的存在[7]。

1 ?噴氣燃料中的特征微生物

李鵬認為[8]微生物進入噴氣燃料可能有兩個途徑，部分是大氣中的微生物通過油罐呼吸等方式進入噴氣燃料并進行繁殖生長，部分可能是油藏內源微生物。據報道[9]，有些微生物是在油藏形成過程中帶入沉積環境的微生物，它們在生長發育過程中細胞質脫水濃縮，形成休眠狀態的微生物，即芽孢。芽孢對熱、干燥、輻射及消毒劑具有很強的抵抗能力[10]，因此能夠抵抗石油煉制過程的高溫，然后進入燃料，并在適宜的條件下吸水膨脹重新發育成有繁殖能力的微生物。

水分、碳源、氮源和無機鹽是微生物生長必須的營養要素[11]。噴氣燃料在儲運和使用過程中，雨露冰霜侵入、容器中水蒸氣凝結、燃料所處環境溫度變化以及人員操作不規范等原因，往往會導致一些水分的混入。這些水分通常以游離水、溶解水狀態存在。游離水是懸浮在油中的水粒或沉淀在容器底部的水分;溶解水是由于燃料中烴類微弱的溶水性而溶解到燃料中的水分。燃料中這些微量的水分便能滿足微生物生長所需，尤其是儲油容器底部、輸油管路下凹部位沉降的水層更是如此。噴氣燃料主要成分是烷烴、環烷烴和芳香烴等烴類化合物，均能被微生物當作碳源進行代謝。所需氮源主要來自噴氣燃料中添加劑以及供油系統材料，如腈橡膠、聚氨酯類物質;無機鹽可能來自燃料本身[12， 13]。

噴氣燃料中微生物種類繁多，而且受地域等因素影響，噴氣燃料中微生物的種類也有所區別。楊浩等[14，15]從我國西南不同區域的5個油庫取的5個油樣中，檢測到的微生物分屬11個門、44個綱、90個目、151個科、217個屬。郭玲玲等[16]在培養基上對噴氣燃料油樣中微生物進行培養、鑒定。結果顯示，每毫升罐底油樣、沉淀罐油樣在瓊脂培養基上分別檢測到3 688個、4 957個菌落，僅通過形態學就鑒定出8種細菌、6種真菌，還不包括生長緩慢等原因導致未鑒定出的微生物。

雖然噴氣燃料中包含有多種微生物，但是不同種類微生物在噴氣燃料中豐度不同。有些微生物的豐度相對較高，且普遍存在于噴氣燃料中，這類微生物即為噴氣燃料的特征微生物。Ferrari，M.D等[17]在1990-1996間收集了350個噴氣燃料油樣并分析微生物污染情況，發現污染微生物主要有油相中的枝孢菌（Cladosporium）、曲霉菌（Aspergillus）和水相中的假單胞菌（Pseudomonas spp）、硫酸鹽還原菌（Sulphate reducing bacteria）等。袁祥波等[18]在不同油樣中均培養出了一種真菌，并將其鑒定為枝孢霉屬Amorphotheca resinae真菌。楊浩等[19]在不同區域取得的6個油樣中均培養出了枝孢霉菌（Amorphotheca resinae）、Khuskia oryzae，帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）以及局限青霉（Penicillium restrictum）。

2 ?噴氣燃料中微生物的主要危害

微生物在噴氣燃料中生長繁殖會消耗燃料的重要成分，影響燃料使用性能;其代謝產物會腐蝕燃料儲供系統、堵塞用油系統精密器件，給飛行安全帶來潛在的災難性后果。

2.1 ?降低噴氣燃料品質

表面活性物質是真菌和細菌代謝的副產物，不僅會降低燃料的表面張力，增強油水乳化現象，使油中的水分不易分離出去，而且還會使燃料中的一些細微雜質在過濾器上聚集，影響過濾效果，進而影響燃料的低溫性和潔凈性[20-22]。微生物在生長過程中，會利用燃料中的部分添加劑作為營養成分，而隨著添加劑的消耗，燃料的品質也會有所下降[23]。微生物在利用噴氣燃料中的烴類進行代謝過程中，會降解燃料成分，引起燃料理化指標的變化。崔艷雨等[7]從受微生物污染的儲罐不同位置取樣，在實驗室富集培養，按照標準規定的試驗方法對噴氣燃料相關指標進行檢測，并將結果與未受污染微生物油樣進行對比，發現微生物污染對燃料外觀、總酸值、固體顆粒污染物影響較大，但是對密度、閃點、冰點、水反應、餾程、銅片腐蝕、粘度影響不大。熊云、龍泉芝等[24，25]考察了噴氣燃料特征真菌Amorphotheca resinae對噴氣燃料理化性能的影響，也得出了相類似的結果，即噴氣燃料的外觀、酸值、顆粒度、水分離指數等指標受影響較大，而密度、閃點、冰點、水反應等受影響較小。

2.2 ?影響燃料供給系統

微生物繁殖會堵塞燃油過濾器、金屬過濾網和其他細小孔隙，嚴重影響供油，并使油量表不準確，影響飛機正常工作[2]。微生物繁殖造成燃料系統堵塞可能有兩個原因。一方面促使生成懸浮物。熊云、袁祥波等[26，27]認為，微生物菌絲相互纏繞形成可見的懸浮物，混入油料中的纖維能將菌絲懸浮物勾連到一起形成更大懸浮物，并不斷吸附油料中的塵土等小顆粒物質而成長，進而引起過濾器堵塞等問題。另一方面可以形成生物膜[9]。微生物在生長過程中，會附著在濾網表面形成胞外聚合體，即生物膜，并引起諸如濾網堵塞等一系列問題。含菌油料在流動過程中接觸濾網等物體時，濾網表面會迅速形成有機分子的條件膜，并促使微生物附著在濾網表面，然后微生物開始合成蛋白質，產生胞外聚合物，使微生物固定在濾網表面。微生物分泌的胞外聚合物會吸附油料中的微粒物質和其他微生物，使濾網上的生物膜不斷發育增長，直至堵塞濾網。此外，由于細胞含水較多，因此微生物是電導體。隨著微生物的繁殖，燃料的介電常數會發生變化，造成電容式測量傳感器精度下降，甚至發生短路和失效，影響燃料的計量系統正常工作[11， 28]。

2.3 ?增加燃料的腐蝕性

微生物能在噴氣燃料中繁殖能代謝產生二氧化碳、醇、脂、有機酸等物質，有的微生物還能將燃料中的硫化物轉化為硫、硫化氫等活性含硫物質（如硫酸鹽還原菌，Sulfate-Reducing Bacteria，簡稱SRB），使燃料pH值下降，腐蝕性能增加[2，3]。對于微生物引起腐蝕問題，比較統一的觀點是由微生物代謝產生的活性硫化物導致的。我國學者關于微生物代謝產生活性硫化物的問題，主要有以下幾種觀點[29，30]：一是微生物在油水界面處、罐底沉積物中繁殖，將噴氣燃料中某些非活性硫化物轉化為活性硫化物，引起噴氣燃料腐蝕性[31]。二是33號添加劑含有的硫化物不會使燃料及底層水pH降低，起主要作用的是氧化硫硫桿菌。氧化硫硫桿菌生長繁殖產生硫酸，硫酸與水層硫化物作用生成硫化氫，并導致噴氣燃料出現腐蝕[32]。三是SRB或硫氧化菌利用罐底水中硫化物產生硫化氫，硫化氫擴散進入油相導致噴氣燃料出現腐蝕性。趙升紅等建立了相應傳質模式[33]。

楊浩、郭玲玲等[23，30]認為SRB是對燃料系統危害較大的一種微生物。主要生長在噴氣燃料下面的水相中，能夠以硫酸鹽為電子受體，以有機物和氫為能源和電子供體進行厭氧呼吸。其代謝產物H2S能微量溶解在水和噴氣燃料中，致使燃料的腐蝕性大大增加。

3 ?噴氣燃料中微生物的檢測

噴氣燃料中微生物檢測是加強油料使用管理、判斷燃料污染情況、確保飛行安全的重要手段，鑒別特征微生物種類是研究微生物危害機理、針對性采取防范措施和高效滅菌的前提。

3.1 ?傳統平板培養方法

平板培養法是根據微生物生長所需要的營養物質、水分、溫度、pH等條件，在培養基上人工培養樣品中微生物的方法[11，34]。微生物經過一段時間繁殖生長后，便會形成肉眼可見的各有特征的菌落。因此可以通過平板培養法計算活菌數量，檢驗微生物污染程度，鑒定一些常見的微生物類型。

平板培養法簡單易行，不需要昂貴復雜的專業設備，培養成本較低。但是該方法操作周期長，不能實現實時監控;對操作人員的要求較高，全程不能受其他微生物污染，需要操作人員具有一定的微生物實驗基礎知識;實驗結果具有一定的主觀性，對實驗者依賴較高，不同的人操作可能會得到不同的結果;在樣品中含量較少的微生物，很難通過平板培養法分離得到。因此，在油庫推廣使用具有一定的難度。

3.2 ?國際民航組織推薦的方法

國際航空運輸協會推薦了五種檢測微生物的方法和設備，分別為英國ECHA 微生物學有限公司的MicrobMonitor2法、芬蘭奧林診斷公司的Easicult Combi法、英國生物學分生孢子有限公司的FUELSTATTM resinae法、德國默克集團的HY-LiTE Jet A1燃料檢驗法以及日本San-AI-Oil生產的San-Ai Biochecker FC法[20]。其中前三種方法通過估計給定體積的燃料或水在營養膠中生成的可見微生物菌群數量來定量評定污染等級;FUELSTATTM resinae法是免疫測定法，通過檢測樣品中微生物活性測量其數量，其中活性是根據樣品中微生物凈重測定的;HY-LiTE Jet A1燃料檢驗法通過測量樣品中ATP總量檢測微生物數量，其中ATP總量與樣品中新陳代謝活性有關[20]。

3.3 ?建立在PCR基礎上的16S或18SrRNA測序

核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）存在于所有生物的細胞中，具有重要的生理功能，并且在細胞中相對穩定，包含有反映物種親緣關系的保守序列和反映物種間差異的突變序列[35]。因此依據rRNA保守序列設計一引物，對rRNA進行PCR擴增，然后測定其序列，就可以對其進行物種鑒定。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是指在引物存在的條件下，以樣品DNA為模板，在DNA聚合酶的催化作用下，經過高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟，對特定DNA序列進行體外快速擴增的技術，故又稱為基因的體外擴增法[36，37]。該方法具有特異性高、反應速度快的特點，可在1～2 h內重復25～30個循環，樣品DNA可擴增106～107倍[34]。基于PCR的16SrRNA或18SrRNA測序技術不依賴微生物的培養分離，可以檢測不能培養或生長緩慢的微生物;具有檢測速度快、靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點，在微生物鑒定領域有廣泛的應用。熊云、袁祥波等[27]通過PCR擴增、18S rDNA測序，鑒定了噴氣燃料中的特征真菌為枝孢霉屬（Amorphotheca resinae真菌）;對油樣中懸浮物和真菌DNA進行PCR擴增、凝膠電泳檢測，認為油樣懸浮物中含有真菌，探討了噴氣燃料中懸浮物的形成機理。之后，該課題組通過該技術確定了噴氣燃料中的另外三種特征真菌[15，19]，即Khuskia oryzae、帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）以及局限青霉（Penicillium restrictum）。

雖然RNA測序技術有優良的特征，但在應用中也存在一些不足，譬如檢測過程需要昂貴的專業設備;PCR過程要求比較苛刻的實驗條件，操作過程需在無菌環境進行、試樣不能被其他微生物污染;PCR擴增過程容易交叉擴增，使結果出現假陽性。因此該方法比較適合在實驗室實施，難以在油庫、場站等大面積推廣實施。

3.4 ?LAMP—LFD檢測技術

環介導恒溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification ，簡稱LAMP）是在恒溫條件下，利用四條特殊設計的引物（兩條內引物、兩條外引物）和具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，快速、特異、高效的體外擴增DNA的技術[38]。在酶的作用下，內外引物交替作用形成啞鈴狀結構，然后在酶和內引物的作用下，以啞鈴狀結構為基礎不斷復制目標DNA。LAMP擴增方法具有靈敏度高、特異性強、擴增速度快、設備簡單等諸多優點，是一種高效的擴增方法。

2008年，Kiatpathomchai等[39]將LAMP與橫向流動試紙條快速檢測技術（LFD）相結合，使LAMP擴增產物的檢測更加簡潔、直觀、可靠。該方法將擴增產物用生物素標記，再與FITC（異硫氰酸熒光素）標記的特異探針進行雜交，然后將試紙條垂直放入含雜交產物的檢測液中或吸取少量雜交產物滴加到試紙條上。該復合物經層析膜進行擴散，擴散到檢測線時生物素標記的擴增產物被生物素配體捕捉，試紙條上會出現有顏色的肉眼可以直接觀察的檢測線，而未被捕捉的復合物繼續擴散，擴散到質控線時被特異性抗體捕捉，并在試紙條上形成可觀察的質控線[22，40]。LAMP-LFD簡便易行，不要求昂貴的專用儀器，只需要水浴鍋或加熱器等簡單的恒溫設備即可（60～65 ℃）;對操作者要求不高，不需要專業的生物學知識;實驗結果客觀易判，對操作者的經驗、對顏色類實驗現象的敏感度等主觀因素依賴較少。目前，LAMP-LFD已在病毒、細菌、真菌快速檢測等領域得到了廣泛應用。Kiatpathomchai等[39]將逆轉錄環介導等溫擴增法（RT-LAMP）與橫向流量試紙條技術（LFD）相結合，用目測的方法簡單、快速的檢測出了蝦桃粒病毒（ TSV）特異性的擴增產物;對將RT-LAMP-LFD的靈敏度與RT-LAMP-凝膠電泳進行了對比實驗，結果顯示，前者靈敏度比后者高了100倍，而比巢式PCR-凝膠電泳高了10倍。熊云、和倩倩等[22，41]以枝孢霉菌（A.resinae）18S rRNA為模板基因，設計了四組引物，通過LAMP-LFD實驗篩選了效率最高的引物組、優化了實驗條件，建立了檢測檢測噴氣燃料特征真菌A.resinae的快速實驗方法，并對比了LAMP-LFD與PCR-凝膠電泳兩種方法的靈敏度和特異性，結果顯示前者靈敏度更高、特異性更強。隨后該課題組[15]建立了噴氣燃料中另外三種特征真菌帚狀曲霉（Aspergillus penicillioides）、局限青霉（Penicillium restrictum）以及Khuskia oryzae的LAMP-LFD快速檢測方法，并與PCR-凝膠電泳法進行了靈敏度、特異性和重復性對比實驗，得出了相同的結論。

LAMP-LFD技術作為一種新穎的微生物檢測方法，不僅克服了PCR法擴增過程中需要溫度循環、擴增完成后需要電泳檢測、需要昂貴的操作儀器等弊端，而且具有靈敏度高、特異性強、擴增速度快、結果易于檢測、反應時間短、檢測成本低等無可比擬的優點，因此具有較為廣泛的應用，是噴氣燃料儲存、使用過程中實時監控微生物污染情況的理想方法。但是該方法也有一定的不足，譬如引物設計復雜，有較高的特異性要求，而且高效引物篩選也需要大量的實驗;擴增完成后，檢測過程不是在密閉容器進行，產物可能會擴散到環境中，并導致實驗結果假陽性。

3.5 ?ATP發光法

三磷酸腺苷（ATP）存在于活細胞中，是生物體中最重要的能量載體，它作為“能量貨幣”參與細胞新陳代謝過程中能量的儲存、轉移與釋放。由于所有生物細胞中都含有恒量的ATP，細胞裂解后會將ATP釋放出來。在ATP和鎂離子的環境下，熒光素酶可將蟲熒光素氧化成帶電激發狀態。激發態的分子釋放一光子后回到基態，反應過程如下式所示[11]：

蟲熒光素+熒光素酶+ATP

蟲熒光素—熒光素酶—AMP+ppi+O2

氧化熒光素—熒光素酶—AMP+H2O

氧化熒光素+熒光素酶+AMP+hv（560 nm）

A.Thore等[42]通過實驗表明，微生物與ATP濃度之間具有相關性，而通過標準曲線可得ATP濃度與熒光值之間的相關性，故微生物與熒光之之間具有相關性。事實上，當ATP含量在一定范圍時，活細胞對數值與ATP發光值的對數值之間存在線性關系[43，44]，因而可以通過測定ATP熒光值計算微生物數量。叢苑等[44]分別通過平板計數法和ATP發光法測定了玉米中霉菌數量，驗證了兩種方法所得結果之間的相關性，說明了通過ATP發光法測定霉菌數量的可靠性，還篩選了有效的霉菌ATP提取方法和提取條件、建立了檢測玉米中霉菌數量的ATP快速檢測方法。邱穎等[45]分別用ATP發光法、平板計數法測定了水中細菌的ATP發光值和細菌總數，然后用統計學方法分析兩者對數的相關性。結果顯示，當水中細菌數在一定范圍時，ATP發光值對數與細菌總數對數之間呈良好的線性關系。崔露露[46]在不同OD600nm下，分別對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行平板計數、測定發光強度，結果顯示細菌數與發光強度以及兩者對數值之間均具有良好的線性關系，再次驗證了ATP發光發的可靠性;優化了測定條件，建立了天然水中細菌總數的ATP快速測定方法。

ATP發光法不僅具有操作簡便、快速的特點，而且測定范圍較廣，可以一次檢測出全部活體微生物的含量;ATP熒光法是一種即時操作方法，測定的微生物含量即為取樣時的含量，沒有時限延遲，可以實現飛機油箱、儲油罐的在線檢測。但是該方法也存在靈敏度不夠高、反應體系最佳條件難以確定、結果易受游離ATP干擾以及不能用作微生物種屬鑒定等弊端[47]。然而在噴氣燃料微生物污染程度的監控中，該方法依然是比較有效的檢測手段，只要嚴格按照規程操作，足以滿足監控需求。熊云、李澤振等結合我國噴氣燃料實際情況，建立了用ATP發光法檢測噴氣燃料中微生物污染程度的方法，篩選了高效的提取液、裂解液，優化了檢測設備。

4 ?展 望

目前，噴氣燃料微生物污染問題已逐漸引起人們的重視。但由于噴氣燃料國家標準沒有對微生物做出規定，日常化驗中沒有微生物檢測項目，沒有公認的微生物污染等級標準和檢測標準，在儲存、使用過程中并沒有對微生物進行監控，這增加了燃料被微生物污染的風險和飛行安全隱患。所以下一步應重點研究以下幾個方面：

（1）量化噴氣燃料中微生物污染等級標準，明確處于不同污染等級燃料的處理措施;

（2）制定微生物檢測標準，規范實驗操作程序;

（3）優化實驗設備，提高實驗效率、降低實驗成本。

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