耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機制的研究進展

劉曉敏 邰文琳

（1云南省中醫醫院檢驗科 云南 昆明 650021）

（2昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科 云南 昆明 650021）

肺炎克雷伯菌(klebsiellapeneumoniae，Kpn)屬于革蘭陰性腸桿菌科細菌，廣泛存在于自然界和人類上呼吸道，也是常見的條件致病菌，可引起支氣管炎、尿道感染、菌血癥、腹膜炎、肝膿腫、甚至腦膜炎等嚴重疾病。碳青霉烯類抗生素是一種結構與青霉素類似的抗生素，抗菌譜廣泛、活性最強的非典型β-內酰胺抗生素，被稱為對抗革蘭陰性細菌的最后一條防線。我國上市的碳青霉烯類抗生素有5個品種：亞胺培南、美羅培南、帕尼培南、比阿培南和厄他培南。碳青霉烯抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)：專指對碳青霉烯類抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌。CRKP分離率逐年增多，根據《2015—2016年CHINET的檢測報告》CRKP在腸桿菌科中的檢出率增加至15%左右[1]。這種超級細菌通常只對少數抗生素敏感，給臨床治療和醫院感染控制帶來了極大的困難。感染這種超級細菌的患者死亡率很高，在美國一項關于針對CRKP測序研究中發現，可歸責于CRKP感染的死亡率竟高達33%[2]。根據XuL等人的調查，2462名感染CRKP的患者的總死亡率為42.14%，而在世界范圍內，北美、南美、歐洲和亞洲的研究報告的死亡率分別為33.24、46.71、50.06和44.82%[3]。根據TianX等人的調查，大多數的CRKP來自下呼吸道和泌尿道感染，并且大多數感染者住院，尤其是ICU患者，大部分合并有其他疾病，導致感染主要風險因素包括：碳青霉烯類和第三代頭孢菌素的廣泛使用、機械通氣、鼻胃導管和中央靜脈導管等有創性治療措施導致。2018年國家醫政醫管局發布了《碳青霉烯類抗菌藥物臨床應用專家共識》，規范化了碳青霉烯類抗生素的應用原則，包括：嚴格控制適應癥、規范該抗生素在兒童和特殊人群中的應用、以及加大感控力度、專檔管理、主動篩查等措施[2]。如能主動進行篩查攜帶者和感染者，對提高患者治愈率和降低死亡率有著積極的作用。

1.碳青霉烯抗生素耐藥的肺炎克雷伯菌菌CRKP的耐藥機制

大量研究表明CRKP的耐藥機制是多因素聯合作用的結果。最主要有：產碳青霉烯酶、超廣譜β-內酰胺酶或AmpC酶聯合孔膜蛋白缺失或低表達、主動外排機制、以及生物被膜形成等多因素聯合的耐藥機制。有研究表明產酶是主要導致耐藥的機制，而孔膜蛋白缺失聯合超廣譜-β內酰胺酶或AMC酶導致的耐藥能使碳青霉烯類MIC值降低，在耐藥機制中起到了重要的輔助性作用[3]。

1.1 超廣譜-β內酰胺酶（ESBLs）或AMC酶合并孔膜蛋白缺失或低表達導致的耐藥機制

超廣譜-β內酰胺酶（ESBLs）是一種能夠有效水解β內酰胺類抗生素的酶，作用范圍廣泛，包括第三代頭孢菌素（頭孢哌酮、頭孢曲松等）和單環酰胺類（氨曲南等）抗生素，但此酶可以被加酶抑制劑（如克拉維酸、他唑巴坦等）所抑制。超廣譜-β內酰胺酶（ESBLs）的基因型主要包括TEM、SHV、CTX-M、PER和VEB等類型，世界流行以TEM型和SHV型最常見，我國則以CTX-M-15最常見。AmpC酶是一種頭孢菌素酶，不被克拉維酸等酶抑制劑所抑制，只對四代頭孢和少量抗生素敏感。按照Ambler分子分類法（按氨基酸和核酸序列分類）AmpC酶屬于C類，由AmpC基因編碼產生。AmpC酶分為由染色體介導，和由質粒介導兩種類型。染色體介導的AmpC酶包括誘導型和結構型兩種，誘導型可在有誘導性的β-內酰胺類抗生素（頭孢西丁、亞胺培南、頭孢孟多等）作用下，導致基因ampc的強表達。兩種類型的主要機制都是通過ampc基因實現的，主要有拷貝數增加、轉錄增加、或獲得插入序列中含有強啟動子等機制。1988年首次發現由質粒介導的AmpC酶MIR-1，至今已有40余種基因型。目前世界范圍內最流行的基因型是CMY-2，與CMY-2有關的質粒有IncI1，IncF，IncF-IncI，IncA/C和IncR。我國肺炎克雷伯菌產生的AmpC酶主要基因型是DHA基因型。肺炎克雷伯菌的兩個主要孔膜蛋白名叫OmpK35、OmpK36，由各自同名的基因編碼，MarkG.Wise等人的研究發現，約83.0%對厄他培南不敏感的分離株中存在ompK35和ompK36的基因突變。在厄他培南的MIC值最高(＞4mg)的菌株中，60.5%的兩個孔蛋白基因都發生了突變。與厄他培南敏感對照組相比，發現90.4%的菌株存在一種主要OmpK孔膜蛋白的缺乏或低表達。

1.2 碳青霉烯酶

碳青霉烯酶是一種能高效水解碳青霉烯類抗生素的酶，它是肺炎克雷伯菌產生耐碳青霉烯類抗生素最主要、最重要的機制。大部分產酶的菌株仍然對粘菌素、替加環素等少數抗生素敏感，但有些細菌甚至對這些藥物具有耐藥性。根據Ambler分類的碳氫霉烯酶主要是A類、B類金屬β-內酰酶和D類碳青霉烯酶。A類碳氫霉烯酶主要包括：KPC、SME、NMC-A、IMI、GES、SFC-l等，其中由質粒編碼的KPC酶是最常見的酶，該酶的編碼基因可位于質粒、整合子等可移動的基因元件上，可在不同菌種（屬）間傳播。KPC-1酶是最早被發現的碳青霉烯酶，2001年美國亞特蘭大喬治亞州CDC中心YigitH，QueenanAM等人報道了一個新型的β-內酰胺酶，這個基因就是等電點pl6.7的KPC-1。隨后各國和地區都相繼報道了產KPC酶的肺炎克雷伯菌在本地區的流行情況。QiY等人通過分析來自中國5個省9個城市13所醫院的95株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，發現所有的耐碳青霉烯類抗生素的菌株均產生了KPC-2酶。根據FuP等人的研究也證實了肺炎克雷伯菌ST11是產KPC酶的肺炎克雷伯菌的主要克隆類型。而這種耐藥基因能夠通過質粒等移動元件在同種甚至不同種屬的細菌間傳播，可能是導致其蔓延原因。也有研究表明KPC酶僅能使菌株對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性下降，多表現為低水平耐藥，而高水平耐藥常有其他耐藥機制共同存在。根據IoannisGaldadas等人對A類碳青霉烯酶KPC-2的結構研究可得知，A類酶具有一個空間結構上高度保守的區域，稱為“疏水網絡”，正是這些結構保持了該酶的穩定性。并用實驗驗證了如果能破壞這些空間折疊結構就能使酶的功能喪失，從而使耐藥性喪失。隨著2014年阿維巴坦在美國上市，相繼有頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥菌株報道，此研究的新療法提供了另一個抗耐藥菌新思路。B類碳青霉烯酶是金屬酶，因其活性部位結合有金屬離子鋅Zn，金屬離子在酶中起到催化作用。包括IMP、VIM、NDM、GIM、SIM、SPM、AIM等型別，其中以IMP、VIM型為主，其中我國產IMP的肺炎克雷伯菌以IMP-4、IMP-8型為主。以世界范圍的流行情況來說，產VIM金屬酶的肺炎克雷伯菌以VIM-1、4、5、23基因型為主。近年來新金屬酶被不斷報道，新的金屬酶基因型相繼被報道，2018年BrinkacLM等在尼日利亞的一所醫院兒科分離到了一株NDM-5。

1.3 D類碳氫霉烯霉

OXA酶Ambler分子分類法屬于D類β-內酰胺酶，由于其對于苯唑西林、氯唑西林有很強的水解能力，且不被克拉維酸所抑制，因此命名為OXA型酶。至今已報道了91種OXA型酶。其中世界范圍以OXA-48最為常見，該酶由blaOXA-48基因編碼，是地中海地區分布最廣泛的碳青霉烯酶。根據西班牙一項研究表明西班牙CRPK中碳青霉烯酶OXA-48型占91.38%。但根據MarianaCastanheira等人的報道歐洲地區近年來OXA-48及其變異體檢出呈增長趨勢，從4.3%增加到2014-2016年的12.6%。

1.4 外排機制的作用

肺炎克雷伯菌目前發現的主要外排系統是AcrAB-TolC外排泵系統，由周質融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和藥物質子轉運子AcrB構成。該系統存在于肺炎克雷伯菌內膜上，通過主動外機制排消耗能量將抗菌藥物、消毒劑等排出細菌外，導致細菌胞內的藥物、消毒劑的濃度減低，無法發揮滅菌作用。研究表明肺炎克雷伯菌對β-內酰胺、大環內酯類、氟喹諾酮類、四環素類和酰胺醇類抗生素耐藥與主動外排系統AcrAB-TolC的關系密切，是肺炎克雷伯菌產生多重耐藥性的重要原因。肺炎克雷伯菌的AcrABTol外排泵基因主要有oqxA.oqxB.emrD.tehA.mdfA及qacE1-△sull等。根據鄭軒的研究，約93%的多重耐藥的肺炎克雷伯菌同時攜帶多種外排泵基因。根據馬建新、徐燕等的研究，外排基因中qacE1-△sull和mdfA檢出最多，分別達到了95%和85%。

1.5 生物被膜形成

生物被膜可以在細菌表面生成，可能協同孔膜蛋白和外排系統對抗生素起到抵抗和減少胞內濃度的作用。生物被膜在肺炎克雷伯菌中檢出率非常高，達90%以上，多重耐藥菌與非多重耐藥菌生物膜形成能力并沒有明顯差異，但生物膜的形成能夠促進外排基因AcrA的表達，使得排外作用的增強。根據俊田學斌、劉海洋等的研究表明：肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與luxS基因表達量有關，luxS可能是一個高階調控基因，可調控很多病原菌的生物膜形成，該基因與外排泵基因ramA、孔膜蛋白基因ompK36和調控基因micF等基因構成錯綜復雜的關系網，共同影響生物膜的形成。

2.總結和展望

綜上所述，CRKP耐藥主要機制是產碳青霉烯酶，而高水平的耐藥和泛耐藥是由于多因素的作用而導致的，這個復雜多變的機制導致了臨床治療非常困難，而很多酶基因的編碼基因位于可轉移基因元件上，易導致耐藥基因在同種或不同菌種間傳播，造成嚴重的院內交叉感染和耐藥菌爆發擴散，是醫院感染和爆發流行的潛在隱患，不容忽視。如果能提前篩查攜帶者和感染患者，對ICU等提高有合并癥患者治愈率和降低死亡率有著十分積極的作用。