維替泊芬影響骨肉瘤MG63細胞增殖和遷移侵襲的作用機制

陳蔚，余鈴，陳敬騰，夏露，郭衛春

骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性骨腫瘤，好發于青少年，生長迅速且惡性程度高，預后極差［1］。20世紀70年代新輔助化療的引入使病人5年生存率提高到65%～70%，保肢手術的開展也使病人生存質量得到顯著改善［2］。但是出現化療耐藥和遠處轉移的病人仍預后不良，5年生存率不足20%［1，3］。因而尋找更加有效的針對骨肉瘤的治療藥物具有十分重要的意義。

Hippo通路是一種進化上高度保守的信號轉導通路，通過控制細胞增殖和凋亡起到調節器官大小和維持組織穩態的作用。經典Hippo信號通路核心成分有哺乳動物STE20樣蛋白激酶1/2（mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2）、接頭蛋白Salvador同源物1（Salvador homolog 1，SAV1）、大腫瘤抑制基因1/2（large tumour suppressor 1/2，LATS1/2）和 MOB 激酶活化劑 1（Mob kinase activator 1，MOB1），Yes-相關蛋白 1（Yes-associated protein 1，YAP1）。其中YAP1為Hippo信號通路下游的轉錄共激活因子，通過調節各種轉錄因子的活性參與細胞增殖、凋亡、化療耐藥和血管生成等過程［4-5］。目前越來越多研究證實YAP1在許多惡性腫瘤中高表達，并且參與腫瘤發生、發展以及復發。Wang等［6］發現YAP1可以調節骨肉瘤細胞的增殖能力及其對化療藥物的敏感性，表明YAP1可能是治療骨肉瘤的潛在藥物靶點，尋找針對YAP1的抑制劑有望為治療骨肉瘤病人帶來新的曙光。

維替泊芬是一種苯并卟啉類衍生物光敏劑，臨床上用于治療新生血管性黃斑變性［7］。然而有研究表明維替泊芬可作為非光敏激活劑治療多種疾病［8］，如維替泊芬能抑制YAP1基因的轉錄和翻譯，在沒有光激活的情況下破壞YAP1與靶蛋白TEA轉錄因子（TEADs）相互作用，從而調控多種腫瘤細胞增殖和凋亡，如乳腺癌和前列腺癌等［9-10］。但目前尚未見維替泊芬作用于骨肉瘤的報道。本研究于2018年6月至2019年3月觀察不同濃度維替泊芬對骨肉瘤MG63細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、侵襲及轉移能力的影響，初步探究了維替泊芬抗骨肉瘤作用的相關分子機制，以期為維替泊芬治療骨肉瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料人骨肉瘤MG63細胞購于中國科學院細胞庫上海保藏中心（批號TCHu124）。維替泊芬購于Selleck公司（批號S1786），DEME高糖培養基購于美國Hyclone公司（批號SH30022.01），新生胎牛血清購于Gibco澳洲公司（批號10099-141）；1%雙抗（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL）（批號G4003）、二甲基亞砜（DMSO，批號D2650）和胰蛋白酶（批號G4004）購于武漢賽維爾生物科技有限公司；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑盒購于南京碧云天公司（批號C0038）；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒與細胞周期檢測試劑盒（批號KGA108-1，KGA511）購于南京凱基生物科技發展有限公司；8.0 μm孔徑TranswellTM小室（批號PI8P01250）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，批號ISEQ00010）均購于Millipore公司；兔抗人Yes相關蛋白1（YAP1，批號4912S）、TEA轉錄因子1（TEAD1，批號D9X2L）、磷酸化Yes相關蛋白1（pYAP1，批號D9W2I）、β-肌動蛋白（β-actin，批號13E5）抗體均購于美國CST公司；實驗所用儀器包括自動酶標儀、流式細胞儀和倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 骨肉瘤MG63細胞培養于含有10%新生胎牛血清，1%青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 μg/mL）的DEME高糖培養液中，放置在37℃、5%二氧化碳培養箱中培養，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 取對數生長期的骨肉瘤MG63細胞以5×104/mL濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，孵育24 h待細胞貼壁后加入不同濃度的維替泊芬（0、2、4、6、8、10 μmol/L），分別培養24、48、72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續孵育2 h，用自動酶標儀測量每孔細胞在450 nm波長的吸光度值。所有試驗均進行3次。

1.2.3 細胞周期檢測 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理骨肉瘤MG63細胞24 h后，收集細胞，用冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，用70%乙醇固定1 h后再用PBS洗滌1次，然后用200 μL冷PBS重懸細胞，再加入1 mg/mL核糖核酸酶A（RNase A）和50 μg/mL PI，混勻后避光孵育30 min，隨即用流式細胞儀分析細胞周期分布。

1.2.4 細胞凋亡分析 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理骨肉瘤MG63細胞24 h后，收集細胞，用冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min后去上清，將細胞制成單細胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，避光孵育15 min，然后再加入400 μL結合緩沖液，隨即用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.2.5 劃痕實驗 取對數生長期的MG63細胞，以每孔5×104個接種于12孔板中，待細胞長到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在每個孔底劃出1條直線，PBS洗滌2次，用倒置顯微鏡拍照后，分別加入無血清DMEM高糖培養基，并調整維替泊芬濃度為0、2、4、6、8 μmol/L，繼續培養48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕-愈合度，拍照記錄，每組實驗重復3次，按下列公式計算細胞遷移率：

1.2.6 TranswellTM侵襲實驗 將TranswellTM小室放入24孔板中，每孔上室加入50 μL稀釋后的基質膠（無血清DMEM培養基稀釋），然后于37℃恒溫無菌培養箱中培養4 h，吸出基質膠表面的液體。收集維替泊芬處理過的骨肉瘤MG63細胞，重懸后加入上室，每孔細胞約4×104個，下室加入500 μL含150 mL/L胎牛血清的完全培養基。各組上室中分別加入DMSO、終濃度為2、4、6、8 μmol/L的維替泊芬后，于37℃恒溫無菌培養箱中培養24 h。取出小室，應用無菌棉簽擦去小室內殘留的細胞，甲醛中固定20 min，然后用PBS清洗，后加入結晶紫染色10 min，晾干后于倒置顯微鏡下觀察濾膜底附著的細胞數，統計侵襲細胞數。每組隨機選取5個視野（×100），每組實驗均獨立重復3次。

1.2.7 蛋白質印跡法（Western Blot） 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理MG63細胞48 h后用細胞裂解液提取總蛋白，吸取40 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后用5%脫脂奶粉于室溫封閉1.5 h，加入相應一抗孵育4℃條件下孵育過夜。濾膜經TBS緩沖液漂洗3次后加入相應二抗，室溫搖床孵育2 h。在暗室中將PVDF膜用發光劑顯色曝光后分析結果，β-actin蛋白條帶作為內參。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以xˉ±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細胞增殖CCK-8結果顯示，隨著維替泊芬作用時間延長和使用濃度增加，其細胞活力不斷下降，24、48、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為（6.592±0.121）μmol/L、（4.668±0.075）μmol/L、（2.953±0.078）μmol/L。說明在0～10 μmol/L濃度區間內，維替泊芬可以呈時間、濃度依賴性地抑制MG63細胞的增殖。其中24 h內各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細胞存活率分別為：（81.43±1.70）%、（73.50±1.34）%、（56.10±1.56）%、（39.17±0.78）%、（33.27±8.1）%；48 h內各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細胞存活率分別為：（75.63±1.30）%、（56.87±1.43）%、（44.67±1.83）%、（28.37±0.93）%、（22.97±1.30）%；72 h內各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細胞存活率分別為：（63.2±0.90）%、（41.40±1.40）%、（24.00 ± 1.28）%、（17.30 ± 1.28）%、（8.40 ±1.47）%。見圖1。

圖1 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細胞增殖

2.2 維替泊芬導致骨肉瘤MG63細胞周期阻滯流式細胞術結果顯示。與對照組相比，不同濃度的維替泊芬處理24 h后，處于G0/G1的細胞比例顯著上升，G2/M期細胞比例變化不明顯，而S期細胞比例則明顯降低，且呈濃度相關性。這一結果提示維替泊芬可以導致骨肉瘤MG63細胞周期阻滯于G0/G1期。其中24 h內各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）G0/G1期比率分別為：（43.33±0.89）%、（57.33±0.89）、（66.67 ± 0.88）%、（72.67 ± 0.88）%、（86.00 ±1.53）%（F＝236.61，P＜0.05）；各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）S期比率分別為：（36.33±1.21）%、（23.67±0.88）%、（14.67± 0.88）%、（8.33±0.88）%、（4，33±1.53）%（F＝194.82，P＜0.05）；各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）G2/M期比率分別為：（19.00±0.58）%、（16.67±0.88）%、（20.00±1.73）%、（19.33±0.88）%、（18.33±0.81）%（F＝1.42，P＝0.30）。見圖2。

圖2 不同濃度維替泊芬影響MG63細胞周期分布

2.3 維替泊芬誘導MG63細胞凋亡不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細胞24 h后，采用Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡率，結果顯示不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理24 h均可誘導MG63細胞凋亡，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），且凋亡率隨著維替泊芬濃度的增加而逐漸增高。各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）細胞凋亡率分別為：（6.19±0.52）%、（8.02±0.43）%、（10.95±0.95）%、（25.44±0.40）%、（32.19±0.82）%（F＝302.68，P＜0.05）。見圖3。

圖3 維替泊芬處理MG63 24 h后對骨肉瘤MG63細胞凋亡率的影響

2.4 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細胞遷移和侵襲細胞劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細胞后遷移率均降低，6 μmol/L和8 μmol/L維替泊芬處理組開口區域明顯增寬，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖4A）。同樣，Transwell實驗結果顯示維替泊芬處理后MG63細胞侵襲性下降，其中6 μmol/L和8 μmol/L處理組較對照組顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖4B）。其中各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）劃痕閉合率分別為：（48.33 ±0.88）%、（42.33 ± 2.60）%、（40.00 ± 2.87）%、（36.67 ±3.18）%、（28.00±3.79）%（F＝6.99，P＝0.006）。各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）細胞侵襲數分別為：（137.00±5.29）個、（124.67±6.77）個、（115.67±6.17）個、（110±5.13）個、（87.33±3.71）個（F＝11.25，P＝0.001）。

2.5 維替泊芬抑制YAP1及其相關靶基因的表達采用蛋白質印跡法檢測YAP1及TEAD1表達的變化。結果顯示，不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細胞24 h后，YAP1及其轉錄因子TEAD1的表達水平均降低（P＜0.05），而磷酸化YAP1表達水平不變（見圖5），提示維替泊芬能抑制MG63細胞的YAP1及其下游靶基因TEAD1表達。

3 討論

越來越多研究表明細胞信號轉導通路介導骨肉瘤耐藥，如磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、Notch、Wnt/β-catenin 及葡萄糖轉運 蛋 白（GLUT1）等［11-14］。有文獻報道Hippo信號通路參與骨肉瘤耐藥過程，且其關鍵分子YAP1可能成為骨肉瘤治療的藥物靶點［6］，尋找Hippo信號通路上游藥物作用靶點抑制劑有望為骨肉瘤治療帶來新的希望。

圖4 維替泊芬處理MG63 24 h后對骨肉瘤MG63細胞遷移（A）與侵襲（B）的影響

圖5 維替泊芬對骨肉瘤MG63細胞Yes-相關蛋白1（YAP1）、磷酸化Yes-相關蛋白1（pYAP1）、TEA轉錄因子1（TEAD1）蛋白表達的影響：A為蛋白電泳圖；B為量化圖

目前維替泊芬作為非光敏劑治療多種腫瘤的研究引起許多學者的注意［8］，蔣玉林等［9］研究證實維替泊芬可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移及侵襲，而Al-Moujahed等［15］證實維替泊芬可抑制膠質瘤LN229和SNB19細胞體外生長。然而關于維替泊芬對骨肉瘤細胞的影響還尚未有報道。本實驗探究了維替泊芬對骨肉瘤細胞株MG63細胞增殖和凋亡的影響，發現維替泊芬能夠抑制MG63細胞的增殖，使MG63細胞周期阻滯于G0/G1期，并促進其凋亡，且均呈濃度依賴性，這與Zhang等［11］在胰腺導管腺癌中的研究結果相一致。同時，本研究發現維替泊芬對MG63細胞的遷移及侵襲能力具有抑制作用，且呈濃度依賴性。

近年來，越來越多研究表明維替泊芬作為YAP1抑制劑在治療各種腫瘤中發揮著重要作用［16］。YAP1作為Hippo通路的核心效應蛋白，可轉移至細胞核內通過與TEAD1蛋白以及其他轉錄因子形成復合物，觸發下游靶基因如Areg的轉錄，進而促進腫瘤形成［4］。研究表明維替泊芬能夠作用于YAP1-TEAD1復合物，破壞其結構后預防致癌性生長達到抑制腫瘤的作用［16］。Liu等［17］研究證實，體內高表達YAP1或者失活神經纖維瘤病Ⅱ型（NF2）會引起肝臟組織過度生長，而采用維替泊芬治療后肝臟的生長速度受到抑制。Brodowska等［18］研究視網膜母細胞瘤細胞的生長和生存能力機制時，發現維替泊芬能夠干擾YAP1-TEAD1復合物的形成，從而延長癌細胞的倍增時間。李美嬌等［19］研究發現維替泊芬通過下調YAP1、TEAD1表達抑制鼻息肉細胞生長；Wei等［10］也發現維替泊芬通過摧毀YAP1-TEAD1復合物可以抑制胰腺導管腺癌存活、血管生成及仿血管發生。本實驗采用蛋白質印跡法檢測了維替泊芬處理后YAP1、pYAP1、TEAD1的蛋白表達水平，結果顯示YAP1、TEAD1表達下調，而pYAP1表達不變，與上述研究結果相符，表明維替泊芬可能通過下調YAP1、TEAD1，阻止YAP1與TEAD1相結合，抑制MG63細胞的增殖、遷移及侵襲能力，而促進其凋亡。

但是本研究也存在一些缺陷。首先，本研究僅采用了一種骨肉瘤細胞系進行研究，是否適用于其他骨肉瘤細胞系及原代骨肉瘤細胞尚需進一步研究；其次，本研究沒有進行動物體內實驗，是否在體內同樣具有良好的效果值得進一步探討；另外，本研究設置的觀察時間和濃度范圍較窄，雖然發現了時間、濃度依賴性，但不能排除可能存在平臺期和峰值濃度，尚需深入研究。