CRISPR/Cas 9介導的基質Gla蛋白基因敲除對破骨細胞分化的影響

趙俐婷，王乃寧，賀芳，張燕

CRISPR/Cas 9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR-Associated Proteins）系統是從原核生物中發現的一種防御外源性遺傳物質入侵的自身免疫機制［1-2］，能夠識別自身和外源入侵DNA片段。它具有簡單、方便、高效等特點［3-4］，這種新型基因組靶向修飾技術已被廣泛應用［5-8］。通過人工設計tracrRNA/cRNA復合體，形成單鏈向導RNA（guide RNA，gRNA），使Cas 9蛋白對特定的DNA序列進行靶向切割［4］。隨后DNA通過非同源性末端接合或同源性重組，對斷裂的DNA進行修復，發生替換、移碼或缺失突變，達到基因敲除的目的［9-11］。

基質Gla蛋白（matrix Gla protein，MGP），是最初從牛骨骼中分離出的分子量為14 kD的維生素K依賴性循環蛋白［12］。MGP廣泛存在于骨［13］、軟骨［14］、牙質［15］等組織中，是調節骨形成和軟組織鈣化的重要基質蛋白［16］。MGP基因敲除小鼠出生后由于大動脈硬化破裂于6～8周內死亡［17-18］。MGP基因敲除小鼠還表現為軟骨內骨化缺陷，尤其是生長板軟骨，導致體型短小、骨量減少，提示MGP對成骨細胞分化有一定作用［19］。但迄今為止，尚未見到MGP對破骨細胞分化產生作用的報道。本研究于2018年5月至2019年1月利用CRISPR/Cas 9技術構建了MGP基因敲除的RAW264.7巨噬細胞系，為研究MGP在破骨細胞的功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 RAW264.7細胞系（購于中國科學院細胞庫）用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養基進行培養，293-T細胞用含10%FBS的DMEM培養基進行培養，培養條件為37℃、5%二氧化碳，每隔2 d傳代1次。

1.1.2 試劑 質粒提取試劑盒購于北京TIANGEN公司（批號Q5517）、DNA純化試劑盒購于北京TIANGEN公司（批號R6308）、限制性內切酶BsmBI購于美國NEB公司（批號201805028）、T4連接酶購于西安海寧生物有限公司（批號AH70102A）、α-MEM培養基、DMEM培養基購于美國Hyclone公司、FBS購于美國GIBCO公司（批號42F9081K-2023-1）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）購于美國Pepro Tech公司（批號AF-315-03）、核因子κ B受體活化因子配體（RANKL）購于美國Pepro Tech公司（批號315-11C）、Lipofectamine2000轉染試劑購于美國Thermo Fisher公司（批號11668027）。

1.2 方法

1.2.1 gRNA設計和寡核苷酸鏈合成 利用MIT在線軟件設計針對小鼠MGP基因的gRNA，在靶序列正義鏈的5’端添加??CACCG，反義鏈的5’端添加AAAC，3’端添加C。

1.2.2 gRNA表達載體構建 使用BsmBI限制性內切酶線性化質粒LentiCRISPRv2，酶切體系為：BsmBI 1 μL，LentiCRISPRv2 5 μg，10×buffer 5 μL，補水至50 μL，55℃酶切過夜。1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切質粒進行分離，利用DNA純化試劑盒回收需要的片段。gRNA寡核苷酸單鏈退火形成雙鏈，退火反應體系為：gRNA Up（100 μM）1 μL，gRNA Down（100 μM）1 μL，10×Buffer 1 μL，補水至 10 μL。95℃反應5 min后自然冷卻至室溫。將退火產物與線性化LentiCRISPRv2質粒連接，連接反應體系為：線性化LentiCRISPRv2質粒200 ng，稀釋10倍的退火產物2 μL，10×Buffer 1 μL，T4連接酶1 μL，補水至10 μL，16℃反應4 h。將連接產物轉化至感受態細胞，37℃過夜培養。挑取陽性克隆，搖菌，次日送公司測序鑒定。將含有正確序列的菌液保種，提取質粒備用。

1.2.3 包裝重組慢病毒 293-T細胞接種于6孔板中，次日當達到70%密度時，利用Lipofectamine2000轉染試劑，分別將800 ng LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1，2，3，ctrl與600 ng psPAX2質粒、200 ng VSVG質粒一同轉染入293-T細胞中。8 h后換新鮮培養基。再過24 h后收集病毒上清備用。

1.2.4 感染RAW264.7細胞及篩選穩定細胞株RAW264.7細胞接種于6孔板中，次日當達到50%密度時，加入含有50%病毒、8 μg/mL聚凝胺（polybrene）的新鮮培養基進行感染。24 h后換含有1 μg/μL嘌呤霉素的新鮮培養基進行篩選（感染成功的RAW264.7細胞具有嘌呤霉素抗性），3 d后收取細胞擴大培養。

1.2.5 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（qPCR）檢測MGP基因敲除效率 提取細胞總RNA，取1 μg進行反轉錄，cDNA稀釋10倍后使用TaKaRa實時熒光定量試劑盒，進行qPCR，反應體系為：2×mix 10μL、正/反向引物（10 μM）0.5 μL、cDNA 模板 5 μL，補水至20 μL。反應程序為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸20 s，40個循環。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因為內參，2-△△CT法進行數據分析。

1.2.6 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測MGP基因敲除效率 收集細胞，用RIPA細胞裂解液提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行凝膠電泳，轉膜后用脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶1 000）孵育1 h，隨后曝光分析灰度值。

1.2.7 qPCR檢測破骨細胞分化標志分子的表達情況 對不同細胞克隆用破骨細胞誘導液（含有30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM完全培養基）進行誘導分化培養，每2天換液1次，5 d后待細胞出現明顯的破骨細胞形態特征（多核、巨大），收集細胞，提取總RNA，具體操作見1.2.5所述，檢測破骨分化標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。

1.3 統計學方法 使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。數據以xˉ±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒的構建與鑒定根據小鼠MGP基因序列，利用網站評分選擇3種gRNA，合成的序列如下。gRNA1：5′-CACCGTTGCCACGGCCAGCGCAGCC-3′，5′-AAACGGCTGCGCTGGCCGTGGCAAC-3′；gRNA2：5′-CACCGAAAGAGGTACTGGAACTCGA-3′，5′-AAACTCGAGTTCCAGTACCTCTTTC-3′；gRNA3：5′-CACCGGCTGTGTGAGCGCTACGCCA-3′，5′-AAACTGGCGTAGCGCTCACACAGCC-3′；對照序列：5′-CACCGCGCTTCCGCGGCCCGTTCAA-3′，5′-AAACTTGAACGGGCCGCGGAAGCGC-3′。將上述寡核苷酸退火后與LentiCRISPRv2質粒連接，構建成LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒，測序鑒定結果如圖1所示，表明重組質粒構建成功。

圖1 LentiCRISPRv2-MGP-gRNA重組質粒測序鑒定結果

2.2 MGP基因敲除效果鑒定

2.2.1 MGP基因敲除效果qPCR鑒定 包裝重組慢病毒并感染RAW264.7細胞，篩選后得到穩定MGP基因敲除細胞克隆，qPCR驗證敲除效率。如圖2所示，以ctrl組作為對照，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細胞的MGP表達水平為對照細胞的（18±4）%，敲除了82%，其敲除效率最佳；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2細胞的MGP表達水平為對照細胞的（36±10）%，敲除效率為64%；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細胞的MGP表達水平為對照細胞的（26±7）%，敲除效率為74%，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 不同RAW264.7細胞克隆MGP的mRNA水平

2.2.2 MGP基因敲除效果蛋白質印跡法鑒定 利用蛋白質印跡法檢測MGP蛋白表達情況，驗證不同gRNA敲除效果。如圖3顯示，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，與對照細胞（ctrl）相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1、2、3細胞克隆的MGP蛋白水平均明顯降低，MGP基因表達被有效地人為干預。

圖3 不同RAW264.7細胞克隆MGP的蛋白水平

2.2.3 MGP基因敲除后對破骨細胞分化的影響對不同細胞克隆用含30 ng/mL M-CSF、100 ng/mL RANKL的10%FBS α-MEM培養基進行誘導分化，每2天換液1次，5 d后收集細胞，提取總RNA，反轉錄成cDNA，qPCR檢測破骨細胞分化標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk的mRNA水平。結果如圖4所示，3種敲除MGP的不同細胞克隆經誘導分化后，與對照細胞（ctrl）［（1.10 ± 0.11）、（1.02 ±0.09）、（1.12± 0.04）］相比，LentiCRISPRv2-MGP-gRNA1細胞的破骨標志分子Itgb3、Acp5、Ctsk mRNA水平分別為（2.29±0.17）、（2.86±0.15）、（2.07±0.13），均顯著增加（P＜0.05）；LentiCRISPRv2-MGP-gRNA2、LentiCRISPRv2-MGP-gRNA3細胞的破骨標志分子的mRNA水平也均顯著增高［（1.79±0.12）、（1.75±0.17）、（1.69±0.09）；（1.62±0.19）、（2.21±0.13）、（1.91±0.15），P＜0.05］。以上結果提示敲除MGP后破骨細胞分化加速，表明MGP抑制破骨細胞分化。

3 討論

CRISPR/Cas 9是一種在基因組水平上由RNA指導Cas 9蛋白選擇性編輯目的基因的方法。由于操作簡單、耗時少，應用日益廣泛［1-4］。在基因敲除、調控基因的表達水平、疾病的基因編輯治療等方面發揮重要作用。相較于其他基因編輯技術，CRISPR中Cas 9蛋白具有不需要形成二聚體來發揮作用，可通過構建多個gRNA實現多重編輯并同時沉默任意數量的單個基因等優勢。

本實驗利用CRISPR/Cas 9技術，在gRNA介導下使含有核酸酶、解旋酶等生物活性的Cas 9酶對MGP基因外顯子特定的DNA序列進行特異性切割，通過非同源性末端接合或同源性重組，在細胞DNA修復作用下，達到敲除基因的目的［9-11］。本研究利用CRISPR/Cas 9技術將RAW264.7細胞中的MGP基因表達水平敲低82%，該穩定RAW264.7細胞系可用于進一步研究MGP功能。

圖4 不同RAW264.7細胞克隆破骨分化標志分子的mRNA水平：A為Itgb3，B為Acp5，C為Ctsk

MGP廣泛存在于軟骨、骨髓、動脈壁等組織中，是一種由84個氨基酸組成的維生素K依賴蛋白，調節骨形成和軟組織鈣化［20］。在骨骼中MGP參與了骨鈣化調節［12］。有研究證實MGP是血管和軟骨組織鈣化的抑制劑，在血管鈣化病變中MGP調節成骨細胞和軟骨細胞的分化［17-18］。MGP可抑制核因子-κB（NF-κB）活性，可能通過抑制RANKL促進成骨細胞分泌骨保護素OPG，促進成骨細胞存活［19］。以上研究揭示了MGP在成骨細胞、軟骨細胞中的作用，而MGP是否參與了破骨細胞分化成熟尚未見報道。

本實驗通過CRISPR/Cas 9技術，建立了穩定低表達MGP的RAW264.7細胞系，利用蛋白質印跡法、qPCR對其MGP表達情況進行鑒定。相比于對照組，MGP基因的表達均明顯降低。進一步對不同細胞克隆進行破骨誘導分化，并通過qPCR檢測其破骨標志分子表達量，結果顯示穩定低表達MGP的細胞克隆，其破骨標志分子的表達水平增高，證實MGP可抑制破骨細胞分化。但MGP參與破骨細胞分化的機制還有待深入研究，我們推測，MGP作為一種胞外基質蛋白，可能通過結合某些蛋白抑制破骨細胞分化。這需要更多的實驗證據，將是我們近期工作的主要方向。