芪蛭膠囊對缺血性中風大鼠豆蔻酰化蛋白激酶C表達的影響

張婷婷 滕堯 陸雪健 王東巖 蔣希成

摘要：目的 ?觀察芪蛭膠囊對缺血性中風大鼠PKC-MARCKS信號通路豆蔻酰化蛋白激酶C（MARCKS）表達的影響，探討其相關作用機制。方法 ?采用線栓法制作SD大鼠大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型，缺血2 h后行再灌注。實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、中藥組和陽性藥組，各給藥組給予相應藥物干預，連續8 d，第8日給藥1 h后造模，除假手術組外，其余3組分為4個亞組，即再灌注后6、24、72 h和7 d組。應用Zea Longa 5分制評分標準對大鼠進行神經功能缺損評分，之后取大鼠腦組織缺血部分，HE染色觀察細胞形態，Western blot檢測MARCKS及p-MARCKS蛋白的表達，RT-PCR檢測MARCKS mRNA的表達。結果 ?模型組大鼠神經功能較假手術組損傷明顯（P<0.05），中藥組和陽性藥組大鼠腦組織再灌注后72 h神經功能評分較模型組明顯降低（P<0.05）;HE染色結果顯示，假手術組大鼠腦組織神經細胞無明顯變化，模型組大鼠腦組織神經細胞受損嚴重，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織神經細胞損傷程度較模型組輕;Western blot和RT-PCR檢測結果顯示，模型組較假手術組大鼠腦組織MARCKS蛋白和mRNA及p-MARCKS蛋白均呈高表達（P<0.05），陽性藥組和中藥組大鼠腦組織MARCKS蛋白、mRNA及p-MARCKS蛋白表達明顯下調（P<0.05）。結論 ?芪蛭膠囊可下調模型大鼠腦組織MARCKS蛋白及mRNA的高表達，進而緩解腦缺血再灌注損傷。

關鍵詞：缺血性中風;腦缺血再灌注;芪蛭膠囊;豆蔻酰化蛋白激酶C;大鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0040-06

Abstract： Objective To observe the effects of Qizhi Capsules on the expression of MARCKS PKC-MARCKS signaling pathway in ischemic stroke rats. Methods The cerebral ischemia-reperfusion model of middle cerebral artery occlusion in SD rats was made by suture method. Reperfusion was performed 2 hours after ischemia. SD rats were randomly divided into four groups： sham-operation group， model group， TCM group and positive medicine group， and each medication group was administered continuously for 8 days. The model was made 1h after administration on the 8th day， the other three groups except for the sham-operation group were divided into 4 subgroups， namely reperfusion 6 h， 24 h， 72 h， and 7 d groups. Neurological deficit scores in rats were evaluated using Zea Longa 5-point scale. The ischemic part of rat brain was taken out. The morphology of the cells was observed by HE staining. The expression of MARCKS and p-MARCKS protein was detected by Western blot. The expression of MARCKS mRNA was detected by RT-PCR. Results The nerve function damage in model group was more serious than that in sham-operation group （P<0.05）. The nerve function score in positive medicine group and TCM group at reperfusion 72 h was significantly lower than that in model group （P<0.05）. The results of HE staining showed thatthe nerve cells in the sham-operation group had no obvious changes， and the nerve cells in the model group were seriously damaged. The damage degree of TCM group and positive medicine group was lighter than that of the model group; Western blot and RT-PCR showed that the MARCKS protein and mRNA and p-MARCKS protein in the model group were over-expressed （P<0.05）. Both the positive medicine group and TCM group could down-regulate the expressions of MARCKS protein and mRNA and p-MARCKS protein （P<0.05）. Conclusion Qizhi Capsules can down-regulate ischemic stroke rats the overexpression of MARCKS protein and mRNA， and then alleviate the cerebral ischemia-reperfusion injury.

Keywords： ischemic stroke; cerebral ischemia-reperfusion; Qizhi Capsules; MARCKS; rats

缺血性中風是常見的危害人類神經系統的疾病，占腦中風比例較大。PKC-MARCKS信號轉導系統腦缺血后被激活，豆蔻酰化蛋白激酶C（MARCKS）在神經功能和神經疾病中扮演重要的角色[1]，其為蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的特異性底物蛋白[2]。MARCKS能調節大腦神經元軸突生長、內吞和胞吐及突觸可塑性等基本過程，揭示MARCKS蛋白在一系列生理過程是一個不可或缺的參與者，參與了大腦皮層的發育與衰老相關的認知能力下降等過程。目前，已知的關于MARCKS的調節機制均與PKC磷酸化有關。本課題組前期研究發現，芪蛭膠囊對大鼠局灶性腦缺血具有保護作用[3]，但其具體分子機制尚不明確。本實驗制作大鼠大腦中動脈閉塞腦缺血再灌注模型，觀察芪蛭膠囊對模型大鼠缺血區腦組織形態及MARCKS、p-MARCKS表達的影響，探討芪蛭膠囊對缺血性中風模型大鼠的作用機制。

1 ?材料和方法

1.1 ?動物

健康雄性SD大鼠80只，SPF級，體質量250～300 g，黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，動物許可證號SYSK（黑）2013-012。飼養于溫度（20±2）℃、相對濕度40%～42%環境，12 h光照，自由攝食飲水。

1.2 ?藥物

芪蛭膠囊（黃芪30 g、丹參20 g、水蛭15 g、地龍15 g等），黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房提供，批號170301;尼莫地平片，哈藥集團三精明水藥業有限公司，批號20180524。

1.3 ?主要試劑與儀器

兔抗MARCKS（20661-1-Ap，Proteintech），兔抗p-MARCKS（11992，CST），山羊抗兔IgG（H+L）HRP（天德悅S004），山羊抗小鼠IgG（H+L）HRP（天德悅S001），GAPDH鼠單抗（天德悅TDY042），超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581），HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co. Ltd，Cat#CW0744）。渦旋振蕩儀（其林貝爾QL-902），離心機（Eppendorf Centrifuge 5415D），分光光度計（Therno Scientific，NANODROP 2000），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，ABI7500），Fresco低溫冷凍離心機（Thermo），MultiSkan3酶標儀（Thermo），Mini P-4電泳槽（Cavoy）。

1.4 ?分組及給藥

實驗大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、陽性藥組和中藥組，其中假手術組6只，其余3組各24只。根據人與動物給藥劑量比例換算，大鼠用藥劑量=人用藥劑量×0.018÷200 g。中藥組給予芪蛭膠囊（2.6 mg/mL）藥液灌胃，陽性藥組給予尼莫地平（3 mg/mL）藥液灌胃，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續8 d。模型組、中藥組和陽性藥組根據缺血2 h再灌注后時間不同隨機分為再灌注后6、24、72 h和7 d共4個亞組。

1.5 ?造模

第8日給藥1 h后開始造模。采用Zea Longa線栓法[4]制作大鼠腦缺血損傷動物模型，即大腦中動脈阻塞模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，于頸部正中線處做一縱切口，分離右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內動脈（ICA）。然后在近心端結扎CCA、ECA，用小動脈夾暫時夾閉CCA遠心端近分叉部，然后在CCA近心端距分叉部4 mm剪一小口，將栓線插入到CCA，輕推栓線達分叉處，松開小動脈夾，從血管分叉處進入ICA，從分叉處插入深度約18 mm，于CCA遠心端用細線結扎，消毒后縫合傷口。術后2 h將栓線拔出約1 cm，行再灌注。假手術組大鼠不插入栓線，其余步驟同其他組。

1.6 ?神經功能缺損評分

參照Zea Longa 5分制評分標準[4]對成模大鼠進行初選：無神經缺損癥狀，0分;不能充分伸展左側前肢，1分;行走時身體向左側轉圈，2分;行走時身體向左側傾倒，3分;不能自發行走，意識水平喪失，4分。選取1～3分者，將不合格大鼠剔除，通過隨機抽樣原則補齊動物數并重新造模。

1.7 ?標本處理

所有實驗組各取2只大鼠行腦組織HE染色，腦組織標本制作經心臟灌流。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（35 mg/kg）麻醉，先灌注生理鹽水約100 mL，再灌注4%多聚甲醛緩沖液。灌注固定完成后，迅速剪取大鼠頭部，用彎鉗小心將缺腦組織剝離，切取2 mm2缺血區腦組織，4%多聚甲醛緩沖液4 ℃固定24 h，組織脫水、透明及浸蠟，常規脫水、石蠟包埋、切片，HE染色。各組余下4只大鼠，其中2只用于大鼠腦組織Western blot檢測，另外2只用于大鼠腦組織RT-PCR檢測。模型大鼠麻醉后冰上斷頭取腦組織，剝離腦組織至冰上，刀片切取缺血區腦組織，置于凍存管中液氮保存，提取總蛋白及總RNA備用。

1.8 ?Western blot檢測豆蔻酰化蛋白激酶C及其磷酸化蛋白表達

將缺血區腦組織剪碎，提取總蛋白。加裂解液，腦組織15 000 r/min勻漿10 s，冰上孵育20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，應用BCA法蛋白定量，酶標儀讀取OD值，分裝后置于-80 ℃冰箱保存。以RIPA調整蛋白濃度，根據目的蛋白分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%，20 μg/孔上樣，通過預染蛋白Marker確定電泳停止時間，然后進行轉模和染色，觀察轉膜效果。用3%BSA-TBST稀釋MARCKS、p-MARCKS蛋白，濃度分別為1∶4000和1∶500，室溫孵育10 min，4 ℃過夜。第2日膜處理后曝光，顯影2 min，定影。拍照保存圖像，分析軟件測定條帶光密度值，以光密度值代表蛋白的相對表達量。

1.9 ?RT-PCR檢測豆蔻酰化蛋白激酶C mRNA表達

用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA，實驗操作按試劑盒說明書進行。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測RNA的完整性。設計引物MARCKS mRNA，用GAPDH作內參。引物設計見表1。用UltraSYBR Mixture（With ROX）進行擴增，實驗操作嚴格按產品說明書進行。擴增步驟：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共45個循環。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠進行電泳。選取樣本cDNA進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作為模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時60～95 ℃進行融解曲線分析，儀器自動繪制出對應的內參基因和目的基因的標準曲線。根據RT-PCR原始檢測結果，用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。

1.10 ?統計學方法

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。實驗數據以 ±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 ?芪蛭膠囊對模型大鼠腦組織神經功能評分的影響

除假手術組外，其余大鼠自缺血再灌注后6 h起即有明顯的神經功能缺損表現，多數大鼠出現患側肢體屈曲內收、雙側伸出不對稱的癥狀，缺損癥狀明顯者多出現行走時向患側轉圈，癥狀越重則旋轉直徑越小，可出現行走時追尾。模型組大鼠神經功能評分缺血再灌注后各時間點整體水平呈下降趨勢，中藥組、陽性藥組較模型組整體評分降低，再灌注后72 h中藥組和陽性藥組較模型組差異有統計學意義（P<0.05），再灌注后7 d中藥組較模型組差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。

2.2 ?芪蛭膠囊對模型大鼠腦組織形態的影響

假手術組大鼠缺血區神經細胞密集，排列整齊，神經細胞形態完整，胞核呈藍色，胞質呈粉紅色，胞核居中，核仁清晰，周圍間隙無水腫;模型組再灌注后72 h大鼠缺血區可見神經元細胞核染色加深，神經元胞漿腫脹甚至破裂，細胞周圍出現間隙，小膠質細胞開始出現，毛細血管充血擴張，血管周圍間隙擴大，可見大量紫色深染的凋亡小體，炎性細胞及膠質浸潤，增生明顯;陽性藥組大鼠較模型組神經元水腫有所減輕，細胞周圍間隙有所減輕，網格排列情況較輕，可見少量紫色深染的凋亡小體;中藥組大鼠較模型組神經元水腫減輕，細胞周圍間隙減小，未見網格排列情況，未發現大空泡;中藥組和陽性藥組大鼠再灌注后72 h較模型組形態差異最明顯，神經元損傷減少，神經元數量增加，神經元腫脹明顯減輕，可見少量紫色深染的凋亡小體。見圖1。

2.3 ?芪蛭膠囊對模型大鼠腦組織豆蔻酰化蛋白激酶C及其磷酸化蛋白表達的影響

模型組大鼠腦組織MARCKS、p-MARCKS蛋白呈高表達，假手術組呈低表達，中藥組和陽性藥組大鼠表達量低于模型組。再灌注后各時間點各亞組顯示，與模型組比較，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖2、圖3、表3和表4。

2.4 ?芪蛭膠囊對模型大鼠腦組織MARCKS mRNA表達的影響

目標基因與GADPH比值顯示，模型組大鼠腦組織MARCKS mRNA呈高表達，假手術組大鼠腦組織呈低表達，與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）。再灌注后各時間點各亞組顯示，與模型組比較，中藥組和陽性藥組大鼠腦組織基因表達明顯下調，差異有統計學意義（P<0.05），2組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表5。

3 ?討論

氣虛血瘀夾痰是缺血性中風主要病因病機。氣虛為本，血瘀為標，瘀血既成，影響氣生血及行血，又使腦絡瘀阻加重。血瘀是缺血性中風的病理核心，氣虛是本病的根源;痰是臟腑功能失調的一種病理產物，亦是導致缺血性中風的基本病理因素之一。故缺血性中風治以益氣活血、祛痰通絡，則血行氣旺，血足氣暢，絡通風消，諸癥痊愈。芪蛭膠囊具有益氣活血、化瘀祛痰、通經活絡功效。方中黃芪為君藥，性甘溫，大補元氣，氣足則血生，氣旺促血行;輔以水蛭、地龍破血逐瘀、通經活絡;丹參補血、活血化瘀;水蛭、地龍與丹參等同用，旨在祛瘀通絡、活血化瘀而不傷正。諸藥合用，共奏益氣活血、祛瘀化痰、通經活絡功效。現代藥理研究表明，黃芪具有清除自由基、抗脂質過氧化、拮抗內皮素的釋放及興奮性氨基酸的毒性作用;并能降低血管通透性，改善缺血后血液流變性[5]205;水蛭肽具有抗腦缺血、保護神經元、減輕細胞損傷的作用[5]221;丹參素具有抗缺血缺氧、抗自由基、抑制細胞內鈣離子升高等作用，對神經細胞具有保護作用[5]266;地龍活性提取物具有減少或修復因腦缺血引起的組織損傷和增加腦血流量、減少腦血管阻力、降低血小板黏附和抑制動物體內血栓形成等作用[5]281。

MARCKS控制大腦中各種細胞類型的蛋白質相互作用。MARCKS能通過PKC將細胞內或細胞外信號傳導到肌動蛋白細胞骨架。在大腦中，MARCKS富含在軸突末端和樹突棘，在突觸前末梢中，MARCKS與突觸蛋白Ⅰ相互作用，與突觸小泡共存，并被PKC磷酸化[1]。MARCKS作為PKC的特異性底物蛋白，是大腦中表達豐富的聯系神經元表面信號與樹突棘可塑性的重要膜蛋白[6]。PKC在腦缺血再灌注損傷中起關鍵性作用，再灌注早期內源性δPKC活化介導的一系列傷害性級聯反應誘發的氧化應激、凋亡、炎癥反應與再灌注損傷密切相關。腦損傷時，MARCKS大量表達，并且MARCKS在PKC的作用下，發生磷酸化反應生成p-MARCKS，可參與跨膜信息傳遞與腦組織的發育[7]，參與細胞的轉移、黏附、分泌及細胞的內攝、外放和吞噬作用[7-8]。缺血性中風發作時，MARCKS蛋白上調，通過PKC的磷酸化反應生成大量的p-MARCKS蛋白，參與細胞的跨膜傳遞并調節細胞機能。另外，有研究表明，小膠質細胞中MARCKS升高對海馬的可塑性和功能有害[9]，凱尼克酸誘導癲癇發作導致小膠質細胞活化，其機制是上調MARCKS的mRNA和蛋白表達[10]。

腦缺血中風梗死病灶由中心壞死區及其周圍的缺血區半暗帶組成。中心壞死區由于嚴重的完全性缺血致腦細胞死亡;而缺血半暗帶因仍有側支循環存在，可獲得部分血液供給，尚有大量存活的神經元，理論上認為如果血流迅速恢復，損傷仍為可逆性，據此提出超早期治療，采取腦保護措施減輕再灌注損傷。實驗結果表明，芪蛭膠囊組能改善缺血區腦組織細胞形態，降低神經功能缺損，對大鼠局灶性腦缺血具有明顯的保護作用。本實驗中模型組大鼠腦組織小膠質細胞出現，MARCKS蛋白及基因表達均高于假手術組和給藥組，因缺血缺氧導致神經元損傷，而小膠質細胞大量存活，激活了與保護/損傷相關的PKC-MARCKS信號通路，神經細胞發生凋亡、壞死。芪蛭膠囊能下調缺血性中風大鼠腦組織MARCKS蛋白及其磷酸化蛋白和mRNA的表達，抑制小膠質細胞的產生。有研究表明，腦缺血狀態下大鼠缺血區腦組織MARCKS和p-MARCKS表達與腦缺血神經元損傷關系密切[11]，芪蛭膠囊治療缺血性中風的機制可能是通過下調缺血區大鼠腦組織MARCKS蛋白的表達，抑制PKC-MARCKS信號通路的激活及小膠質細胞的生成，進而減輕腦缺血對模型大鼠的損傷。

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（收稿日期：2019-06-01）

（修回日期：2019-07-01;編輯：華強）