基于網絡藥理學的石菖蒲治療注意缺陷多動障礙作用靶點及信號通路研究

馮鍇 任昕昕 吳靜靜 于慶洋 黃靖涵 王俊宏

摘要：目的 ?采用網絡藥理學方法篩選石菖蒲治療注意缺陷多動障礙（ADHD）的作用靶點及相關信號通路，進一步明確其作用機制。方法 ?通過中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP）、TCM Database@Taiwan數據庫檢索石菖蒲化學成分并篩選作用靶點，從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數據庫檢索與ADHD相關的疾病靶點，利用Cytoscape3.2.1軟件構建化合物-靶點網絡，并篩選核心網絡，進一步進行GO功能和KEGG通路富集分析。結果 ?共篩選出石菖蒲治療ADHD的化合物65個，與之相對應的作用靶點25個。共涉及信號通路238條，按其生物功能富集分為7組，分別為腺苷酸環化酶-G蛋白偶聯受體信號通路、磷脂酶C-G蛋白偶聯受體信號通路、單胺類神經遞質轉運、腺苷酸環化酶活性的調節、胺類物質轉運的調控、平滑肌收縮功能及血管活性調節。結論 ?本研究初步驗證了石菖蒲治療ADHD的藥理學作用機制，為進一步從細胞生物學層面驗證其作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：石菖蒲;注意缺陷多動障礙;網絡藥理學;成分-靶點;信號通路;機制

中圖分類號：R272.974.93;R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0095-06

Abstract： Objective To screen the targets and related signaling pathways of Acori Tatarinowii Rhizoma for attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） using network pharmacology; To further clarify its mechanism of action. Methods TCMSP and TCM Database@Taiwan were used to screen the active components of Acori Tatarinowii Rhizoma. Disease targets associated with ADHD were retrieved from DisGeNET， ADHDgene， TTD， and DrugBank database. The Cytoscape 3.2.1 software was used to construct a compound-target network and screen the core network. Further analysis of GO function and KEGG pathway enrichment was conducted. Results Totally 65 compounds in Acori Tatarinowii Rhizoma were screened out， and 25 corresponding targets were screened out. There were 238 signaling pathways involved in 7 signaling pathways， which were adenylate cyclase-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， monoamine transport， phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， regulation of adenylate cyclase activity， regulation of amine transport， regulation of tube diameter and smooth muscle contraction. Conclusion This study preliminarily verifies the pharmacological mechanism of Acori Tatarinowii Rhizoma in treating ADHD， and has laid a foundation for further verification of its mechanism from the cellular biological level.

Keywords： Acori Tatarinowii Rhizoma; attention deficit hyperactivity disorder; network pharmacology; component-target; signaling pathways; mechanism

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是一種常見于兒童和青少年的神經精神發育障礙類疾病，可持續到成年，其三大臨床核心癥狀為多動、注意力不集中、沖動。盡管目前的藥物治療，如興奮劑和抗抑郁劑，能夠改善ADHD的癥狀，但仍有約20%～40%的患者不能從中受益[1]。依據其臨床特征，ADHD與中醫學“躁動”“臟躁”“健忘”等證較為相似，臨床醫家多從陰陽失衡[2]、臟腑失調[3]、氣陰兩虛[4]等方面進行辨證論治，所用復方藥味雖多，但必用開竅醒神藥，其中以石菖蒲最為多見[5]。

石菖蒲首載于《神農本草經》，被列為上品，為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的根狀莖，其味辛、苦，性微溫，入心、胃經，具有化濕和胃豁痰、開竅醒神益智的功效。石菖蒲可舒利心氣以解郁寬中，開竅寧神，其清芬之性，走達諸竅而通之，使一身之氣起亟旋展，臨床廣泛用于癲癇、多動癥、阿爾茨海默病、抑郁癥等神經精神類疾病的治療[6]。現代藥理學研究表明，石菖蒲不僅對中樞神經系統具有興奮-抑制的雙向調節作用，而且具有改善學習記憶、抗炎、調節免疫功能等多種藥理作用[7-8]。然而其安神定志、醒腦開竅的具體作用機制尚不明確。

中藥具有多成分、多靶點的特點，因此對中藥的相關研究必須采取整合策略，以多學科間的交叉融合為基礎，構建新的研究體系[9]。網絡藥理學是在網絡生物學與多向藥理學的基礎上提出的藥物設計思路[10]，其闡述的藥物與疾病靶點之間相互聯系，與中醫整體觀念等核心思想相一致。它強調了將生物學網絡與藥物作用網絡整合，分析藥物在網絡中與節點或網絡模塊的關系，由尋找單一靶點轉向綜合網絡分析，借助高通量技術、網絡可視化技術及網絡分析技術，構建出由藥物與疾病基因之間復雜的交叉網絡[11]。通過網絡節點間的關系來分析網絡特性，進一步闡明藥物作用機制。本研究采用網絡藥理學的方法，進一步明確石菖蒲的有效成分及作用靶點，探討其改善ADHD核心癥狀的作用機制。

1 ?資料與方法

1.1 ?藥物化學成分收集與篩選

本研究以“石菖蒲”為關鍵詞，通過中藥系統藥理數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php，V2.3）和TCM Database@Taiwan（http：//tcm. cmu.edu.tw/，更新至2014年3月25日）檢索石菖蒲的所有化學成分及對應靶點[12]。

對所檢出的石菖蒲化學成分進行篩選。篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%[12]，血腦屏障滲透度（BBB）≥-0.3[13]。其中，OB是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）等特性研究中重要的藥代動力學參數，較高的OB可減少用藥量，同時在一定程度內減少藥物不良反應的發生。此外，ADHD病因研究提示其多與腦內神經遞質紊亂有關，對于治療ADHD的藥物而言，BBB是影響其生物利用度的另一個關鍵因素。因此，本研究選用OB和BBB作為篩選石菖蒲活性成分的指標。

1.2 ?疾病靶點篩選

通過DisGeNET（http：//www.disgenet.org，V5.0）、ADHDgene（http：//adhd.psych.ac.cn/，更新至2014年2月14日）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/，更新至2017年9月12日）及DrugBank數據庫（https：//www.drugbank.ca/，V5.1.0）檢索與ADHD相關的基因。

1.3 ?藥物與疾病關聯靶點網絡的構建

將篩選后的石菖蒲化學成分作用靶點及ADHD疾病靶點錄入Cytoscape3.2.1軟件。存在交集的蛋白質很有可能是石菖蒲活性成分治療ADHD的靶點。由于靶點信息來源不統一，故使用Uniprot數據庫（http：//www.uniprot.org/）對得到的靶點信息進行校正，獲得人類相關靶點的Uniprot ID。采用Cytoscape3.2.1軟件的Network Analysis插件，以平均自由度為標準，對石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點網絡進行拓撲分析，篩選核心網絡。

1.4 ?富集分析

利用Cytoscape3.2.1軟件的ClueGO和CluePedia插件對篩選出的核心網絡靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，探討石菖蒲化學成分的靶點通過調控目標基因功能和信號通路改善ADHD核心癥狀的作用機制。

2 ?結果

2.1 ?藥物活性成分

以OB≥30%、BBB≥-0.3作為篩選條件，共得到石菖蒲的活性化學成分63個。值得注意的是，elemicin和gamma-asarone兩成分的OB<30%，但二者均為石菖蒲較為重要的活性成分[14-15]。因此，本研究共納入65個石菖蒲活性成分（TCM Database@Taiwan數據庫檢索相關結果已涵蓋在TCMSP數據庫檢索結果內），具體見表1。

2.2 ?藥物與疾病的化合物-靶點網絡

本研究通過比對從TCMSP數據庫納入的篩選后石菖蒲活性成分對應的靶點和從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數據庫收集的ADHD疾病靶點，共得到石菖蒲-ADHD共同作用靶點25個。石菖蒲-ADHD的化合物-靶點網絡見圖1。

2.3 ?藥物與疾病的化合物-靶點核心網絡

采用Cytoscape3.2.1插件Network Analysis以平均自由度為標準對網絡進行拓撲分析，共得到石菖蒲活性成分7個（8、13、32、37、46、47、51號）及相關治療靶點21個，見表2。石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點-疾病核心網絡見圖2。

2.4 ?信號通路分析

本研究采用Cytoscape3.2.1軟件的ClueGO和CluePedia插件對石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點-疾病核心網絡中的靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，共發現信號通路238條（見圖3）。按其生物功能富集分析結果分為7組，分別為腺苷酸環化酶-G蛋白偶聯受體信號通路、磷脂酶C-G蛋白偶聯受體信號通路、單胺類神經遞質轉運、腺苷酸環化酶活性的調節、胺類物質轉運的調控、平滑肌收縮功能及血管活性調節。見圖4。

3 ?討論

為進一步探究石菖蒲改善ADHD核心癥狀的化合物及其作用的疾病靶點與信號通路之間的關系，本研究以OB和BBB為篩選條件，從TCMSP、TCM Database@Taiwan數據庫篩選出石菖蒲的活性成分，從DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank數據庫檢索與ADHD相關的疾病靶點，兩者映射比對后，以平均自由度為標準，確定了石菖蒲治療ADHD的化合物-靶點核心網絡，涉及信號通路238條。本研究篩選出的石菖蒲治療ADHD的作用靶點已被證實參與了本病的發生發展過程[16]，包括單胺類神經遞質、5-羥色胺、神經遞質轉運體、單胺氧化酶、乙酰膽堿等。富集分析表明，石菖蒲治療ADHD的大多數潛在靶點與神經遞質受體的活性和轉運密切相關。G蛋白偶聯受體（GPCR）是單胺類神經遞質信號轉導中不可或缺的介質，GPCR編碼基因的突變被認為是ADHD發病的重要因素，另外，從GPCR信號轉導的角度來看，聚集在前額葉皮層和紋狀體的GPCR呈現出多態性，這種多態性有助于其通過下調兒茶酚胺類神經遞質及5-羥色胺的再攝取過程，從而發揮控制多動癥狀及減緩認知損害的作用[17]。神經活性配體受體通路和5-羥色胺能突觸功能證實了神經遞質配體和受體之間的各種相互作用，單胺類神經遞質相關基因的表達改變與其密切相關[18-19]。cAMP信號通路通過影響AC-cAMP-PKA信號轉導的調節性神經遞質（多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺）影響人類認知功能[20]。研究表明，蛋白激酶G（PKG）介導了cGMP的一些神經元效應[21]，而且cGMP-PKG是調節蛋白磷酸酶、細胞內鈣水平和神經遞質受體以發揮神經功能的關鍵分子位點[22]。

由此可見，即便是單味藥，其發揮藥效的化合物成分種類、作用靶點及機制也較為復雜繁多，增加了中藥研究的難度。多成分、多靶點、多環節治療疾病是中醫藥的優勢所在，隨著精準醫學的興起，中醫藥防治疾病的優勢日益受到關注，但同時亦存在物質基礎不明、作用靶點不明、療效機制不明的發展困難。網絡藥理學技術借助高通量數據分析，構建成分-靶點-信號網絡，可一次性處理非單一成分、靶點、途徑的復雜通路，適用于中藥作用機制的現代研究。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，對石菖蒲的多成分、多靶點與ADHD疾病靶點之間的復雜網絡關系進行分析，在臨床療效確定的基礎上，初步驗證了石菖蒲治療ADHD的藥理學作用機制，為進一步從細胞生物學層面深入研究奠定基礎。

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