基于iTRAQ技術的天然富硒與非富硒水稻差異蛋白分析

曾 睿 張 果 鄭騰達 粟 陽 葉小英 賈曉梅 朱建清

(四川農業大學水稻研究所1,成都 611130) (都江堰市農業農村局2,都江堰 611830) (成都農業科技職業學院3,成都 611130)

同位素標記相對定量和絕對定量技術(iTRAQ)是通過利用同位素標簽標記的特異性標記多肽，經質譜分析對樣品蛋白或肽段進行準確的定性鑒別和定量分析技術，同時可以對不同樣品中蛋白質進行絕對或相對含量的比較，尋找差異蛋白及功能[1]。iTRAQ方法具有良好的定量和較高的重復性，能科學揭示不同生理狀態的胞內蛋白質的動態變化過程。目前水稻蛋白質組學的研究發展迅速，已有在水稻各個組織器官、亞細胞表達、突變體、激素誘導和環境脅迫等方面的研究，獲得水稻各生長發育階段組織器官表達特異性以及水稻自身如何通過調控降低對逆境脅迫的影響[2-10]，但在水稻品質營養研究中鮮見報道。

本實驗采用iTRAQ技術對天然富硒與非富硒水稻進行定量蛋白質組學研究，分析兩種不同基因型水稻蛋白質組表達水平的差異，并對差異蛋白質進行GO(gene ontology)功能注釋和分類、KEGG代謝通路分析，以獲得水稻不同基因型生物學相關的蛋白譜信息，找出天然富硒與非富硒水稻蛋白組表達水平的差異，從而對水稻富硒形成的蛋白質機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通過引進“紅寶石”紅米種質資源，從現有的水稻品種中篩選出稻米硒含量高的種質資源作為親緣，選育和培育富硒紅米雜交稻Z3057A 、Z3057B。富硒紅米雜交稻Z3057B(Oryza sativa L.)和非富硒水稻成恢 727(Oryza sativa L.)，由四川農業大學水稻研究所四川省國際科技合作示范基地提供，Z3057B精米中硒元素含量為0.049 mg/kg，達到國家富硒稻米的標準(GB/T 22499—2008，硒含量為0.04～0.30 mg/kg)。

1.2 儀器與設備

Thermo DINOEX Ultimate 3000型高效液相色譜儀；色譜柱為Durashell C18(5 μm，10 nm，4.6×250 mm)，Durashell C18分析柱(5 μm，10 nm，4.6×250 mm)；AB SCIEX nano液相質譜儀，AB SCIEX分析柱 (75 μm內徑，充填3 μm，12 nm的ChromXP C18柱料，長12 cm)，NEW objective噴針(20 μm內徑，噴針口的直徑是10 μm)，eksigent Chromxp Trap Column捕獲柱(3 μm C18-CL,12 nm,350 μm×0.5 mm)；Thermo CV200型真空離心濃縮機；5424 R冷凍離心機；UV-2202紫外分光光度計；7900HT定量PCR反應擴增儀。

iTRAQ Reagents-8plex Kit；BCA定量試劑盒；trizol；ReverTra Ace qPCR RT Kit；SYBR Green Realtime PCR Master Mix；甲醇、丙酮、乙腈、甲酸(色譜純)；胰酶(≥600活力單位/g)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取

取5 g水稻樣品放入200 μL TEAB溶解；15 min超聲破碎，12 000 r/min離心20 min取上清；加入4倍體積的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)沉淀2 h； 12 000 r/min離心20 min，收集沉淀；加入800 μL的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)重懸沉淀； 12 000 r/min離心20 min，收集沉淀，然后風干沉淀；加入100 μL TEAB溶解蛋白。

1.3.2 蛋白質定量

采用Bradford定量方法定量總蛋白質[11]；取11只EP管分別標記，精密量取BSA標準溶液(1 mg/mL)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μL加入相應EP管中，測試樣品取1 μL，加入100 μLBCA反應液，渦旋振蕩20 s混勻后離心，60 ℃反應1 h，575 nm測定吸光值。制備標準曲線：y=0.392 7x-0.004 8，R2=0.991 4，定量結果見表1。

表1 樣本定量結果

1.3.3 酶切和除鹽

取100 μg蛋白質，體積整體調節到100 μL，然后加入500 μL50 mmol/L NH4HCO3稀釋，加入2 μg Tryspin酶液；37 ℃消化過夜8～16 h；取出上述酶解液，加入等體積的0.1% FA酸化；取出Strata -X C18柱子先用1 mL甲醇活化，然后加入1 mL 0.1% FA平衡；將酸化后的酶解液加入到Strata-X C18柱子中，連續過3次；然后加入0.1%FA+5%乙腈清洗Strata-X C18柱子，連續清洗2次；取一個新的離心管，向Strata-X C18柱子中加入1 mL 0.1%FA+80%乙腈洗脫1次，收集1 mL液體；冷凍抽干后用20 μL 0.5M TEAB復溶。

1.3.4 標記和等量混合

標記采用8-plex標記(具體操作按照試劑盒說明書進行)；多個樣本標記完以后等量混合。樣品標記為S727和S3057。

1.3.5 High pH C18分組分

將混合后的樣本分成12個組分， LC-MS/MS條件：A為0.1% 甲酸，5% 乙腈；B為0.1 % 甲酸，95 % 乙腈；上樣緩沖液:0.1% 甲酸，3 % 乙腈。LC-MS/MS的液相方法以90 min為例，上樣5 μL。質譜結果見表2。

表2 LC-MS/MS質譜檢測結果/%

1.3.6 蛋白質鑒定和生物信息分析

本次實驗采用基于質譜方法的蛋白質組鑒定基本流程，即對MS/MS質譜數據經過系列優化處理后與數據庫進行相似性比較打分從而進行蛋白鑒定。采用ProteinpilotTM V4.5對肽段的MS/MS的數據在水稻轉錄組數據庫中進行檢索。選擇unused score≥1.3(即可信度水平在95%以上)，每個蛋白至少包含一個unique肽段的蛋白為可信蛋白[12]，對其進行t檢驗，當差異倍數達到1.5倍及以上(即up_regulate≥1.5和down_regulate≤0.67)，且經過顯著性統計檢驗其P≤0.05時，視為顯著差異蛋白。利用注釋工具對差異蛋白進行基因功能聚類GO分析，采用KEGG通路數據庫對差異蛋白涉及的代謝通路進行分析。

1.3.7 熒光定量PCR(qPCR)驗證

為了驗證iTRAQ結果，選擇部分差異蛋白進行mRNA表達水平的驗證。按照Trizol試劑盒操作手冊提取總RNA，取1 μg總RNA反轉錄成cDNA，步驟和體系按照說明書進行。以cDNA為模板，用Real-Time PCR內參基因actin引物做Q-PCR擴增，驗證cDNA的質量。反應條件為95 ℃、1 min,1個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40個循環。實驗重復3次，采用2-△△Ct進行相對表達量計算。引物序列使用Primer 5.0 設計和公布的序列(表3)，反應程序參照 BIO-RAD CFX ConnectTM Flex Real-Time PCR System 進行。

表3 qPCR 引物序列

2 結果與分析

2.1 質譜鑒定結果

質譜數據經過Proteinpilot軟件對水稻轉錄組數據庫進行檢索，報告置信度在95%以上的蛋白質共3 235個，其中定量蛋白質有3 161個；差異蛋白為401個，其中上調差異蛋白193個，下調蛋白208個。將鑒定蛋白質分布的理化性質主要范圍通過圖示化，蛋白分子質量的范圍在8.2～611.3 ku之間，等電點的范圍在3.48～12.77之間，疏水性的范圍在-2.01～1.29之間，見圖1。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 GO注釋

GO是全面描述生物體中基因和基因產物的屬性，主要是對蛋白質的分子功能、細胞位置、生物過程進行分析。這401個差異蛋白中主要參與的分子功能有11個，其中占比例較高的前5個是催化活性(42.52%)、離子結合(40.63%)、轉運蛋白活性(5.21%)、結構分子活性(4.24%)、酶調節活性(2.49%)；細胞位置11個，所占比例較高的前5個是細胞(26.00%)、細胞組分(26.00%)、細胞器(22.30%)、細胞器組分(10.72%)、高分子復合物(5.79%)；生物過程26個，其中所占比例較高的前5個主要是代謝過程(17.66%)、細胞過程(17.52%)、應激反應(9.75%)、生物調節過程(7.02%)、細胞組織合成過程(6.75%)。

2.2.2 COG注釋

COG(蛋白相鄰類的聚簇)是對蛋白質進行直系同源分類的數據庫。將鑒定到的差異蛋白和COG數據庫進行比對，預測這些蛋白可能的功能并對其做功能分類統計。排列前5位的是一般功能預測(16.91%)；蛋白質轉換、翻譯修飾、蛋白伴侶(12.76%)；參與翻譯、核糖體結構和生物起源(8.8%)；碳水化合物的運輸代謝(8.7%)；能量生產與轉換(8%)。

2.2.3 Pathway代謝通路注釋

在生物體內，不同蛋白相互協調行使其生物學行為，基于Pathway的分析有助于更進一步了解其生物學功能。KEGG是有關Pathway的主要公共數據庫[13]，通過Pathway分析能確定蛋白質參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

KEGG代謝通路分析表明差異蛋白一共參與90個信號轉導通路，其中排名前10的代謝通路為淀粉和蔗糖代謝通路(9.03%)、糖酵解和糖質新生代謝通路(9.03%)、內質網蛋白加工通路(6.94%)、核糖體代謝(6.6%)、光合生物碳固定通路(5.21%)、果糖和甘露糖代謝(4.86%)、半乳糖代謝(4.17%)、氨基酸和核苷酸糖代謝(4.17%)、嘌呤代謝(4.17%)、丙酮酸代謝(4.17%)，見表4。

圖1 差異蛋白的蛋白分子質量范圍、等電點范圍及疏水性范圍

表4 差異蛋白的代謝通路分析

2.2.5 篩選蛋白的信息

根據差異蛋白的表達量、分子功能和代謝通路，篩選出77個目標差異蛋白，見表5。主要分成10類：氧化還原酶、轉移酶、異構酶、熱休克蛋白、裂解酶、水解酶、連接酶、合成酶、微管蛋白、肌動蛋白，分別有27、12、7、5、4、12、2、5、2、1個。

2.3 差異基因的qPCR驗證

生物體中的基因組是遺傳信息的儲存體，mRNA是基因表達中間體，蛋白水平是基因功能的執行體，為了驗證蛋白質在基因水平上的變化是否和蛋白水平一致，選擇了OsAPx02、CatC、riPHGPX、CYS、metE5個蛋白質基因進行qPCR驗證(圖2)。結果顯示，riPHGPX和metE基因的表達水平和蛋白水平呈現出一致性。此外，相對于S3057，S727蛋白下調的OsAPx02、CatC、CYS，在mRNA水平中出現相反的結果。很多研究報道了蛋白質組和轉錄組的不相關或負相關結果，主要可能是蛋白質的翻譯后的修飾(磷酸化、糖基化等)影響蛋白質的分泌和降解[14]；不同基因收到轉錄后調控影響的不一致，從而會導致不同基因水平表達會出現一定的差異；基因轉錄后mRNA的穩定性與特定的核苷酸及相應的結合蛋白有關[15]。

圖2 差異蛋白的qPCR分析

表5 富硒水稻與非富硒水稻之間顯著差異的蛋白表達分析

續表5

續表5

3 討論

實驗結果表明，富硒與非富硒水稻在蛋白質組表達水平存在差異，差異蛋白為401個，其中上調差異蛋白193個，下調差異蛋白208個。生物信息學分析得出77個目標差異蛋白，主要分成氧化還原酶、轉移酶、異構酶、熱休克蛋白、裂解酶、水解酶、連接酶、合成酶、微管蛋白、肌動蛋白。以下為10類目標差異蛋白的功能定性分析。

在27個氧化還原酶中，與天然富硒水稻相比，非富硒水稻中有12個上調和15個下調，這些蛋白主要參與抗應激和生物調節合成過程。其中OsAPx02、CatC、riPHGPX 表達量較高，前兩者為上調蛋白，后者為下調蛋白。OsAPx02屬于APX(抗壞血酸過氧化物酶)基因家族，屬于活性氧酶清除系統的重要成員之一,它參與了細胞內的多種活性氧代謝過程,為維持細胞的正常代謝起了非常積極的作用，研究表明OsAPx02基因可以提高水稻在抗旱、耐鹽和耐低溫環境下的生長發育作用[16]。CAT是植物體內重要的抗氧化酶，也是植物在生長過程中建立的防御系統關鍵酶，CAT能抑制H2O2的過量增長，是植物體內控制H2O2水平和植物細胞的氧化還原平衡的重要酶[17]，CatC在水稻抗逆性方面起到重要作用，增強水稻的防御能力[18]。riPHGPX屬于GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)基因家族，通過調控和催化細胞中氧化還原狀態發揮重要作用[19]。在兩種類型水稻氧化還原酶中，下調蛋白的數目高于上調蛋白，故氧化還原酶在天然富硒水稻中的抗應激、抗氧化和活性氧分解代謝等作用強于非富硒水稻。

在12個轉移酶中，與天然富硒水稻相比，非富硒水稻中有4個上調、8個下調蛋白，這些蛋白主要參與碳水化合物和細胞內氨基酸代謝過程，其中CYS和metE的蛋白表達量較高，前者為上調蛋白，后者為下調蛋白。CYS能催化植物合成半胱氨酸[20]。metE參與甲硫氨酸的合成，在細胞代謝中聯系蛋白質的合成、甲基轉移、多胺和乙烯合成等重要的功能[21]。因此，天然富硒水稻轉移酶的碳水化合物代謝和細胞內的氨基酸代謝能力優于非富硒水稻。

異構酶中有7個目標差異蛋白，其中3個上調蛋白，4個下調蛋白，主要參與植物碳水化合物代謝、含氮化合物代謝和植物逆境抗性作用等過程。其中OsI_05445的表達量較高，屬于PDI(蛋白二硫鍵異構酶)基因家族，主要參與在逆境脅迫下對受損蛋白的修復，促進新生肽的合成[22, 23]，說明天然富硒水稻在逆境脅迫條件的抗性能力強于非富硒水稻。

在5個目標差異熱休克蛋白中，與天然富硒水稻相比，富硒水稻中1個位上調差異蛋白，4個位下調差異蛋白，這些蛋白主要參與抗應激和蛋白質折疊的生物過程。Os01g0180800和OJ1540_H01.1基因表達量最高，前者為Hsp70基因，是最保守和最重要的熱激蛋白家族，Hsp70為生物體內組成型表達,在熱激狀態下表達量顯著增加，主要參與新生肽鏈的成熟與分揀以及分泌蛋白向細胞器或胞外的轉運[24]。后者為Hsp90基因，同樣具有高度保守性,并參與植物細胞內多種蛋白的正確調控與維持其正常構象與功能,保證細胞在逆境脅迫下能正常存活[25]，兩者均為下調蛋白，因此在熱休克蛋白方面，天然富硒水稻參與抗應激能力強于非富硒水稻。

在4個裂解酶中，與富硒水稻相比，非富硒水稻中有2個上調和2個下調蛋白，這些蛋白主要參與生物合成過程。其中GAD(谷氨酸脫羧酶)的表達量較高，為下調蛋白，GAD是γ-氨基丁酸(GABA)合成的關鍵酶，具有增進腦活力、安神、調解激素分泌、降血壓、治療癲癇、增強記憶力、改善更年期綜合癥等多種生物學功能。與非轉基因對照比較，轉基因植株具有更高的GAD活性和γ-氨基丁酸含量，說明可通過基因工程增強GAD表達來實現GABA累積的目的[26]。故裂解酶在天然富硒水稻中參與生物合成的作用強于非富硒水稻。

在12個水解酶中，與天然富硒水稻相比，非富硒水稻中有7個上調蛋白和5個下調蛋白，這些蛋白主要參與細胞組織調節和生物合成過程，其中PUL(極限糊精酶)基因的表達量最高，為上調蛋白， PUL屬于淀粉合成途徑中淀粉去分支酶(DBE)，在種子發育整個中期和后期階段高水平表達[27]。在2個連接酶中，主要參與小分子代謝過程，均為上調蛋白。因此，非富硒水稻在淀粉合成途徑作用略強于天然富硒水稻。

在5種合成酶中，分別有1個上調和4個下調蛋白，主要參與抗應激和糖代謝過程，其中SUS(蔗糖合成酶)表達量最高，為下調蛋白，蔗糖合成酶為植物蔗糖代謝的關鍵酶[28]，也參與固氮生物合成過程和非生物脅迫反應過程[29]，這表明天然富硒水稻中合成酶的糖代謝過程強于非富硒水稻。此外，還有2個微管蛋白和1個肌動蛋白，均為下調蛋白，對于保持細胞形狀、運動和信號傳導起到關鍵作用。

4 結論

采用iTRAQ技術的水稻定量蛋白質組學研究方法，找出天然富硒水稻與非富硒水稻蛋白質組表達水平的差異，通過差異蛋白質的生物信息學分析發現，天然富硒水稻的抗應激、抗氧化、活性氧代謝、碳水化合物和氨基酸代謝較非富硒水稻強，但參與淀粉合成途徑作用較非富硒水稻弱。由此可推測CYS和metE可能是導致兩種類型水稻氨基酸差異的2種關鍵蛋白，OsAPx02、CatC、riPHGPX和HSP70、HSP90可能是調節兩種類型水稻抗氧化和抗應激作用的蛋白基因，這將為以后進一步研究富硒水稻相關基因功能、編碼的蛋白的功能及其相應的代謝通路等提供借鑒。