基于宏轉錄組學技術解析傳統酸面團中微生物代謝機理

張國華 王 偉 涂 建 張緯珍 何國慶

(山西大學生命科學學院1, 太原 030006) (浙江大學生物系統工程與食品科學學院2, 杭州 310058)

傳統酸面團，也稱為老面、酵子、面肥或起子，是傳統用于發酵面制品的發酵劑，由酵母菌、乳酸菌及霉菌等多菌群組成的混合發酵體系[1,2]。據報道，傳統酸面團中的乳酸菌超過60種，其中乳桿菌屬為主，舊金山乳桿菌為優勢菌種[3]；有20多種酵母菌[6]，其中釀酒酵母為優勢菌種。傳統酸面團中酵母菌是利用原料中糖類物質轉化為CO2及醇、醛類等物質，形成發酵面制品特有的面筋結構[4]；改善面團特性，如體積，質地和風味，增加營養價值等[5-8]。乳酸菌則可在發酵過程中產生乳酸、醋酸及丙酸等有機酸，與酵母菌相互作用，形成傳統發酵面制品獨特的風味品質[9]。

國外對面包用的傳統酸面團的研究已有100多年的歷史，按照制作工藝的不同，國外將酸面團分為3種[10]，Ⅰ型酸面團主要是利用傳統制作工藝生產的發酵劑，類似我國傳統酸面團，是以舊金山乳桿菌和釀酒酵母菌為優勢乳酸菌[11]，Ⅱ型酸面團主要是一種液態發酵劑，以同型發酵乳酸菌菌種為優勢乳酸菌[12]，Ⅲ型酸面團是一種干燥的粉狀發酵劑[13]，在面包制作過程中常作為酸味劑或增香劑使用。國外研究發現酵母菌和乳酸菌之間存在代謝產物互補機制，酵母菌在發酵過程中為乳酸菌的生長提供了營養因子，而乳酸菌的代謝產物又為酵母菌提供了能量來源[14]。目前，國內酸面團的研究相對薄弱，集中在對我國部分地區的酸面團中微生物多樣性進行了系統研究，研究發現我國酸面團也是以釀酒酵母菌與舊金山乳桿菌為優勢菌種[15，16]，酵母菌和乳酸菌混合發酵面團與活性干酵母發酵相比，總酸度較高，麥芽糖、果糖等可溶性糖變化差異顯著[17]。

宏轉錄組學技術是以樣品中的全部微生物RNA信息為分析對象，從整體水平上研究微生物基因表達情況及轉錄調控規律的技術[18]。本研究基于宏轉錄組學技術，以傳統酸面團Sx樣品為研究對象，對面團發酵前后時期中優勢微生物的變化、功能基因表達及代謝途徑等進行探究，以期闡明饅頭發酵過程中微生物代謝機理，為我國傳統發酵面食工業化的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統酸面團Sx樣品：由山西省臨汾市農家提供；惠宜低筋面粉：市售。

建庫試劑： Ribo-Zero Magnetic Kits； TruSeqTMRNA Sample Prep Kit；

測序試劑： cBotTruseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS；Truseq SBS Kit v3-HS(200 cycles)；

1.2 儀器與設備

NanoDrop2000分光光度計；安捷倫2100；Illumina Hiseq測序平臺；

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

稱取50.0 g的Sx酸面團樣品，加入45 mL蒸餾水，浸泡10～15 min(室溫)，然后混入70.0 g的小麥面粉，攪拌均勻；在溫度28～30 ℃，相對濕度70%～75%左右條件下，發酵2.5～3 h；(取樣品，標記為Sx-1)再補入30.0 g的小麥粉，反復揉面團10～15 min，至面團不粘手、表面光滑；然后定量分割和搓圓，在溫度28～30 ℃、相對濕度70%～75%條件下，醒發40～60 min(二次發酵，取樣品，標記為Sx-2)。

1.3.2 RNA的提取及檢測

對Sx-1和Sx-2樣品進行RNA抽提(試劑盒：TruSeqTMRNA Sample Prep Kit)，然后采用NanoDrop2000和1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度、純度以及RNA的完整性和質量，利用安捷倫2100檢測RIN值。

1.3.3 構建轉錄組文庫并測序

將檢測合格的RNA進行構建轉錄組文庫，采用Illumina Hiseq測序平臺進行測序。

1.3.4 生物信息分析

1.3.4.1 生信分析流程

Sx-1和Sx-2兩個樣品的原始數據經過質控以及去除rRNA后，得到優化數據，進行組裝得到轉錄本信息。對轉錄本信息進行差異表達基因分析：差異表達基因篩選、差異基因模式聚類分析、差異基因的基因本體(GO)注釋、差異基因京都基因與基因組百科全書(KEGG)注釋、GO顯著性富集分析及KEGG顯著性富集分析。

1.3.4.2 物種注釋

用BLASTP(BLASTVersion2.2.28+)將Sx-1和Sx-2兩個樣品基因集與非冗余蛋白數據庫(NR)數據庫進行比對(BLAST設置期望值e-value：1e-5)，獲得參與發酵的物種在屬、種水平上的注釋。

1.3.4.3 功能注釋

GO功能注釋：利用GO數據庫，對Sx-1和Sx-2兩個樣品基因按照其參與的生物過程、分子功能及細胞組分三個方面進行分類注釋。使用 blast2go對基因集進行GO注釋，然后使用GO對應的基因豐度總和計算該GO的豐度。

COG功能注釋：利用基因進化譜系：非監督直余同源群(eggNOG)數據庫，對Sx-1和Sx-2兩個樣品基因集進行比對(BLAST設置期望值e-value：1e-5)，獲得基因對應的直系同源序列聚類，然后使用COG對應的基因豐度總和計算該COG的豐度。

KEGG功能注釋：利用KEGG的基因數據庫，對Sx-1和Sx-2兩個樣品基因信息進行比對(BLAST設置期望值e-value：1e-5)，使用基于KEGG直系同源的注釋系統(KOBAS 2.0)進行注釋。

差異基因注釋：得到兩個樣品的基因表達量之后，使用edgeR 軟件對兩個樣品的基因表達量進行比較，以篩選不同發酵時期顯著差異表達基因，篩選標準為：FDR<0.05且 |log2FC|>1。篩選的差異表達基因進行GO、KEGG注釋，處理方法與GO、KEGG注釋的方法一致。

采用R語言對Sx-1和Sx-2兩個樣品在物種、基因、COG、KEGG和GO功能等層次上進行熱圖聚類分析。

2 結果與分析

2.1 樣品總RNA質量檢測

采用NanoDrop2000對提取的2個樣品的總RNA檢測的純度(OD260/280和OD260/230分別在1.95)和濃度(>50 ng/μL)均較高，達到RNA-seq建庫的要求(表1)。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性較好，2個樣品的RIN值均大于8(表1)，完整性較好，可進行后續生物信息分析。

表1 樣品總RNA質量信息

2.2 測序序列統計與質控

在測序實驗中采用了樣品平行混合測序，各樣品中的序列均引入了一段標示其樣本來源信息的標簽序列(約200 bp)。將原始序列進行統計，見表2。Sx樣品發酵前后的原始序列相比，序列條數增加了1.09倍。

表2 原始序列統計信息

序列優化后，數據統計表見表3， clean reads約占raw reads的80 %左右，而clean bases約占raw bases的70%左右，序列Sx樣品發酵后(Sx-2)的Clean reads約為發酵前(Sx-1)1.14倍。

表3 優化序列統計信息

將優化序列進行組裝拼接，組裝結果見表4。兩個樣品(Sx-1，Sx-2)用于宏轉錄分析的序列條數Seqs分別為15 659、15 670， N50與N90數值表明序列拼接效果較好，可以進一步分析。

表4 序列組裝拼接統計信息

注:N50(N90)：將各轉錄本序列按長度大小排序，從大至小逐一掃描各條序列的長度值，進行累加，當該累加值第一次超過所有序列總長度的50%(90%)時，此時掃描到的序列，其長度值即為N50(N90)；相比序列平均長度，N50(N90)更能準確表示此次的序列拼接效果。

發酵前后Sx-1和Sx-2樣本的序列長度主要分布在1～700 bp以及700～1 400 bp之間，這與表4中N50和N90值相符合，選取這幾個區間段序列長度，可以準確表示此次序列的拼接效果。Sx-2樣本中序列長度在700～1 400 bp之間的數量要明顯小于Sx-1樣本，這可能與發酵前后的差異基因有關，進行下一步生物信息分析。

2.3 物種注釋結果

使用BLASTP將基因集與NR數據庫進行比對獲得不同水平物種注釋信息，有210個種水平物種注釋信息，其中屬水平、種水平的群落分布見圖1與圖2。

圖1和圖2中可以看出，接入Sx酸面團后，在發酵開始階段，以乳桿菌屬所占比例大約為55.47%，而舊金山乳桿菌占菌群的44.41%，說明Sx這個傳統酸面團發酵前微生物中乳酸菌屬中有80.06 %是舊金山乳桿菌。酵母屬所占比例大約39.81 %，而釀酒酵母所占總群落的39.64%，即釀酒酵母占Sx酸面團中99.57 %。而發酵高峰時期， 乳桿菌屬在菌群中所占比例增大到63.51%，而舊金山乳桿菌在整個菌群中所占比例為51.71%，因此，發酵高峰時期，乳酸菌中有81.42%是舊金山乳桿菌。酵母菌屬相對比例降低至32.06%，釀酒酵母在總群落中所占比例為31.91%，即釀酒酵母菌占總酵母屬的99.53%。發酵高峰時期，乳酸菌比例明顯上升，酵母菌比例相對下降，其原因不僅是由于細菌繁殖速度明顯高于真菌，還因為在面團發酵過程中乳酸菌會產生乙酸、乳酸等有機酸，抑制了酵母菌的生長[19]。

圖1 屬水平微生物群落結構圖

圖2 種水平微生物群落結構圖

2.4 GO功能注釋結果

利用GO數據庫，對Sx-1，Sx-2樣品中基因參與的生物過程、分子功能及細胞組分三個方面進行分類注釋。與發酵起始階段(Sx-1)相比較，發酵高峰時期(Sx-2)在催化活性與單一生物過程的基因豐度變化最大，基因豐度增加超過了20%。其次為抗氧化活性、細胞過程、發展過程、代謝過程及轉運活性方面，基因豐度增加了約為10%左右。說明Sx樣品中微生物在這些方面的基因過表達，可能相關的代謝呈現了正調節作用，而在細胞連接、酶調節劑活性、鳥苷酸交換因子活性、大分子復合物等方面，基因豐度呈現降低趨勢，降低比例超過10%。

催化活性方面的基因豐度超過20%，細胞過程、發展過程、代謝過程轉運活性方面的基因豐度超過10%，可能是由于乳酸菌和酵母菌之間存在代謝產物的互補機制，酵母菌在發酵過程中產生的代謝產物可為乳酸菌的生長提供了營養因子，而舊金山乳桿菌生成的葡萄糖可成為酵母菌的能量來源。當發酵體系中乳酸菌生長需要的營養因子過多時，乳酸菌會釋放信號，加速其生長發育速率，縮短生長發育周期，代謝產物增多，又會為酵母菌生長提供更多能量來源，促進酵母菌生長。因此在發酵高峰期，調控催化活性、細胞發育過程以及代謝過程等的基因豐度會相對增加[14]。

四類參與生物過程的差異基因呈極顯著富集(P<0.001)，分別為通過UDP-半乳糖的半乳糖分解代謝過程、碳水化合物代謝過程、碳水化合物轉運和半乳糖代謝過程，主要是參與碳水化合物及半乳糖的代謝過程的相關基因。

參與碳水化合物過程的相關基因變化顯著，主要集中在糖酵解、TCA循環、半乳糖代謝過程中，這些顯著變化會對酸面團風味品質帶來一定影響：其中，麥芽糖是舊金山乳桿菌在發酵過程中優先利用的碳水化合物，參與糖酵解代謝途徑的己糖激酶基因上調表明在酸面團混合發酵過程中舊金山乳桿菌將麥芽糖分解為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸，使得釀酒酵母對葡萄糖的利用率增加[20],此外，果糖也能作為額外的電子受體被舊金山乳桿菌接收，促進了舊金山乳桿菌對它的吸收利用，上述原因使得舊金山乳桿菌與酵母菌可以同時穩定存在于酸面團中，不會由于對碳水化合物的競爭而互相抑制生長[8,21]

單一生物碳水化合物分解代謝過程，碳水化合物分解代謝過程，單一生物碳水化合物代謝過程，己糖代謝過程，單糖代謝過程，半乳糖轉運和半乳糖跨膜轉運蛋白活性，七個具有顯著差異(P<0.01)富集的基因也主要是碳水化合物及半乳糖參與的生物代謝過程。此外，己糖分解代謝過程，單糖分解代謝過程，丙酮酸代謝過程和麥芽糖代謝過程，即單糖相關的代謝過程具有顯著富集差異(P<0.05)。

舊金山乳桿菌與釀酒酵母混合發酵會使釀酒酵母增加葡萄糖的利用，加強氨基酸代謝，減少乙酸、乙醇的合成。這是由于發酵過程中丙酮酸代謝相關差異基因呈顯著富集，其中丙酮酸脫羧酶參與酒精發酵，轉化丙酮酸為乙醛，乙醛再代謝生成乙醇，與丙酮酸代謝的相關基因表達下調導致乙醇含量減少。己糖激酶基因上調表明釀酒酵母對葡萄糖利用增加[23]。

舊金山乳桿菌菌株是以麥芽糖、果糖、核糖和葡萄糖酸鹽作為碳源。當使用果糖、檸檬酸或α-酮戊二酸作為替代電子受體時，通常會加速以麥芽糖為碳源的舊金山乳桿菌的生長，且舊金山乳桿菌的基因組只編碼不完全檸檬酸循環，因為在舊金山乳桿菌中只含有馬酸水合酶、蘋果酸脫氫酶及檸檬酸裂解酶[24]。發酵期間的碳水化合物代謝過程極其活躍，因此參與此過程的差異基因呈極顯著性富集。

轉錄組的結果表明在面團發酵過程中，起主要代謝作用的是釀酒酵母和舊金山乳桿菌，具體菌種參與的具體代謝過程需要進一步進行單菌種轉錄及互作轉錄分析。

對Sx-1與Sx-2兩個發酵階段，微生物差異基因表達進行 GO功能顯著性富集分析，在基因功能水平闡明兩個樣品間的差異。

2.5 COG功能注釋結果

通過與eggNOG數據庫比對，得到基因對應的COG功能分類注釋，其豐度盒裝圖見圖3。

數據庫共注釋了25個COG功能分類，其中與翻譯，核糖體結構和生物學相關的基因豐度值最高，其次為碳水化合物的運輸和新陳代謝的相關基因豐度值較高，且面團發酵前后基因豐度值變化最大。隨著發酵的進行，伴隨的能量代謝相關基因也呈現較大的變化，即能源生產和轉換。這與GO注釋結果也基本一致。

2.6 差異基因KEGG富集分析

傳統酸面團中的各菌種基因表達產物之間存在代謝產物互補機制，并非單獨的發揮作用，不同微生物的代謝產物之間相互協調來實現菌種相互作用。對Sx-1與Sx-2樣品所獲得的差異表達基因進行KEGG注釋，在差異表達基因中顯著富集的KEGG通路(見圖4)。

半乳糖代謝途徑的通路中基因表達富集差異最為顯著(P<0.001)，這與GO與COG注釋結果一致。參與糖酵解、糖異生與氯代烷烴和氯代烯烴降解的代謝途徑的相關基因表達也呈現較顯著的差異(P<0.01)。此外，丙酮酸代謝，芳香化合物的降解，脂肪酸降解和萘降解的相關代謝途徑中基因表達也呈現較為顯著的差異(P<0.05)。

混合發酵過程中，氨基酸代謝過程差異基因也呈顯著性富集，發酵初始階段，由于乳酸菌與酵母菌的生長消耗了大量的氨基酸致使氨基酸的含量有所下降，隨著發酵過程的進行，乳酸菌產生大量的乳酸以及乙酸導致酸面團pH下降，蛋白酶的活性上升，分解蛋白質產生氨基酸，導致酸面團中氨基酸的含量上升[25]，芳香族氨基酸通過轉氨和脫氨途徑產生酸面團中的風味物質[24]。后期階段，苯丙氨酸在酸面團中含量明顯上升，說明乳酸菌與酵母菌混合發酵導致的芳香族氨基酸含量上升對酸面團風味物質的形成具有重要作用。

圖3 Sx樣品不同發酵時期基因表達的COG注釋結果

注：P<0.001的標記為***，P<0.01的標記為**,P<0.05的標記為*，右側顏色梯度表示P值大小。圖4 Sx樣品不同發酵時期基因表達的KEGG富集分析結果

丙酮酸途徑中，由于丙酮酸氧化酶基因發生移碼，舊金山乳桿菌內丙酮酸直接轉化為乙酰磷酸是無法實現的，因此舊金山乳桿菌首先通過乳酸將丙酮酸轉化為乙酸，然后從乙酸生成乙酰磷酸。丙酮酸鹽可由舊金山乳桿菌生產，除了通過磷酸酮醇酶途徑從糖和葡萄糖酸鹽形成外，還可由天冬酰胺和丙氨酸通過轉氨基作用產生以及蘋果酸脫氫酶催化的蘋果酸產生。在發酵過程中，丙酮酸代謝過程相對活躍，因此參與丙酮酸代謝途徑的相關基因表達富集呈現較為顯著差異[22]。

2.7 差異物種表達模式聚類分析

對Sx-1與Sx-2兩個樣品中物種進行熱圖聚類分析，篩選顯著差異物種進行表達模式聚類分析。Sx-1與Sx-2兩個樣品間群落結構模式聚類圖表明Sx兩個發酵階段中，相對豐度高的物種都是釀酒酵母和舊金山乳桿菌，這說明這兩個菌種是Sx發酵過程中起著關鍵作用的物種，這與先前的研究結果相一致。腸系膜明串珠菌、干酪乳桿菌等菌種在發酵后，相對豐度有所增加，而類谷糠乳桿菌的菌種在發酵后，相對豐度略有降低。

經過傳統酸面團Sx發酵后的面團，不同物種的基因表達呈現一定的差異，但是總體而言，兩個樣品的群落結構相似性更大，差異性相對較小。

3 結論

通過宏轉錄組學技術，對傳統酸面團Sx樣品發酵不同階段中優勢菌種的變化、關鍵功能基因注釋及代謝途徑等進行了分析，結果表明Sx樣品發酵過程中是以乳桿菌屬與酵母菌屬為優勢菌屬，而其中主要以舊金山乳桿菌與釀酒酵母為關鍵優勢菌種。在Sx酸面團發酵過程中，參與碳水化合物及半乳糖代謝過程相關的差異基因呈極顯著富集，基因豐度超過20%，說明在酸面團發酵過程中，這兩種代謝途徑占據重要地位。本實驗對傳統酸面團Sx樣品在面團發酵前后微生物菌群結構、功能基因表達及代謝途徑的研究，探討面團發酵過程中起關鍵作用的菌種，為進一步研究傳統發酵面食的品質影響因素提供參考。