GnRH拮抗劑方案對黃體中期子宮內膜免疫細胞數量的影響

徐士儒，許健，陳聰，陳婉如，武婭婭，曾勇，李玉葉*

(1. 深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳 518043；2. 深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳 518043)

控制性超促排卵(COH)可以成功獲得多個成熟卵子，其應用于輔助生殖技術后，大大提高了體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠成功率。隨著COH藥物及方案的發展，如何選擇合適的COH方案，成為臨床醫生關注的焦點。IVF的成功取決于夫婦雙方的自身條件和IVF臨床實施過程的調控，在胚胎實驗室技術和環境穩定的前提下，臨床促排卵方案的選擇對臨床結局的影響至關重要。目前，常用方案主要包括促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案和近年來新興的GnRH拮抗劑(GnRH-ant)方案。

GnRH-ant是下丘腦分泌產生的肽類激素，其主要的生理作用是促進性腺激素的釋放，即黃體生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。GnRH-ant可通過與垂體GnRH受體結合，阻斷內源性GnRH的作用，以抑制促性腺激素的釋放，進而抑制內源性LH釋放，減少FSH的產生。國內外大量臨床研究已證實GnRH-ant方案有效、簡便、靈活、安全，且作用更加迅速[1]，因此GnRH-ant在輔助生殖領域得到了廣泛的應用。也有越來越多的研究表明，與傳統GnRH-a長方案相比，GnRH-ant方案可獲得相似的臨床妊娠率及活產率[2-3]。然而研究發現與GnRH-a相比，GnRH-ant方案的新鮮周期移植妊娠率比較低，但是采用凍融胚胎移植(FET)時兩者的妊娠率并無顯著性差異，提示GnRH-ant對內膜可能存在不良影響[4]。文獻報道GnRH-ant組子宮內膜容受性標志性分子同源框基因10(HOXA10)的表達顯著下降[5-6]，然而有研究發現與自然周期相比較，GnRH-ant方案對子宮內膜組織形態學的影響并無明顯差異[7]。因此，GnRH-ant方案對子宮內膜容受性的影響仍存在爭議。

在胚胎種植過程中，子宮內膜募集大量的免疫細胞并表達多種細胞因子及關鍵分子，參與滋養層侵襲、血管新生、蛻膜化及母胎免疫耐受等關鍵事件，在胚胎著床及胎兒正常生長發育過程中發揮重要作用。在種植窗期，若子宮內膜免疫細胞數量發生異常，將導致不良妊娠結局的發生。目前GnRH-ant方案是否對子宮內膜免疫細胞數量產生影響尚未見相關報道。因此本研究收集了育齡婦女自然周期黃體中期、GnRH-ant與GnRH-a方案取卵后黃體中期的子宮內膜樣本，探討GnRH-ant方案對子宮內膜免疫細胞數量的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年5～11月在深圳中山泌尿外科醫院生殖醫學中心行IVF-ET治療的女性為研究對象，納入標準：(1)年齡20～40歲；(2)B超及子宮輸卵管造影排除子宮畸形；(3)近3個月無激素類藥物使用史；(4)月經周期規律，周期28～32 d；(5)排卵日子宮內膜厚度≥8 mm；(6)自然周期B超監測正常排卵的患者或COH周期中獲卵數≥20個為預防卵巢過度刺激綜合征(OHSS)而取消新鮮胚胎移植的患者；(7)FSH<10 U/L，抗苗勒管激素(AMH)>3.0 ng/ml。

嚴格按照納入標準，共納入34例研究對象，按照促排卵方案不同分為3組：自然周期組19例，GnRH-ant組7例，GnRH-a組8例。本研究獲得深圳中山泌尿外科醫院倫理委員會批準，所有樣本的采集均簽署知情同意書。

二、促排卵方案

1.GnRH-ant方案：患者月經周期第2～3天抽血查基礎性激素水平，同時B超監測卵泡狀態，當E2<293.6 pmol/L、FSH<10 U/L且B超最大卵泡直徑<8 mm時，開始促排卵。使用重組人促卵泡素(默克，德國)及注射用尿促性素(珠海麗珠)112.5～225 U/d進行COH，定期監測卵泡生長及血清E2水平，當主導卵泡直徑達到11～12 mm時，加用GnRH-ant(酸醋加尼瑞克，默克，德國)0.25 mg/d直至HCG扳機日，當有3個主導卵泡直徑≥17 mm或2個優勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導下實施采卵術。

2.GnRH-a方案：患者于前一周期黃體中期開始皮下注射醋酸曲普瑞林(達必佳，輝凌，德國)0.1 mg/d，降調16 d后，抽血查基礎性激素水平及B超監測卵泡發育情況，當垂體抑制達到相應標準(E2<183.5 pmol/L，無卵巢囊腫，最大竇卵泡直徑<8 mm)時，開始使用重組人促卵泡素及尿促性素112.5～225 U/d進行COH，定期監測卵泡生長及血清E2水平，當有3個主導卵泡直徑≥17 mm或2個優勢卵泡直徑≥18 mm時，注射HCG 5 000～10 000 U，36 h后在陰道B超引導下實施采卵術。

3. 自然周期方案：自月經周期第10天起，B超結合尿LH監測排卵。

三、內膜標本收集

1.自然周期黃體中期取內膜：自月經周期第10天起，B超結合尿LH監測排卵，排卵后第7～8天，利用子宮內膜取樣器(Gynetics，Belgium，比利時)刮取少量子宮腔內膜組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗去除組織表面血污，于10%中性福爾馬林固定液中固定4～6 h。組織常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟及包埋。

2.GnRH-ant方案和GnRH-a方案取內膜：GnRH-ant方案和GnRH-a方案取卵后取消或自動放棄新鮮胚胎移植患者，取卵后第2天開始黃體酮(安琪坦，博賞，法國)600 mg/d黃體支持，7 d后行內膜抽吸，內膜標本處理同自然周期。

四、子宮內膜形態學分期

常規蘇木素-伊紅(HE)染色，根據Noyes標準[8]，在光鏡顯微鏡下確定子宮內膜分期。

五、免疫組化檢測方法及結果判定

石蠟包埋的子宮內膜組織作4 μm厚度切片，運用自動免疫組化儀(Leica，Bond Ⅲ，美國)進行免疫組化實驗。免疫組化使用的一抗信息：CD56(上海基因科技)，CD68(Novocastra，美國)，CD163(上海基因科技)，CD1a(Novocastra，美國)，CD8(Novocastra，美國)，Foxp3(eBioscience，美國)。

為準確定量分析子宮內膜各免疫細胞的含量，我中心引進Vectra自動病理成像定量分析系統(Perkin Elmer，美國)。首先在低倍鏡下掃描整張切片，然后在高倍鏡視野下(放大率×200)，每張切片隨機采集30張圖像。使用InForm多光譜圖像分析軟件進行圖像的光譜分析，準確探測和測量弱信號以及重疊的信號。根據不同的著色，在病理技術人員的監督下對每張玻片的每種染色進行不同光譜的拆分，訓導軟件自動識別視野下的組織區域、空白區域以及分布在組織區域的陽性免疫細胞和所有子宮內膜細胞，操作流程按參考文獻所述。最后，納入被組織覆蓋面積超過80%的圖像，陽性細胞率定義為陽性免疫細胞數/子宮內膜總細胞數×100%，最終計算30張圖像的平均值為該免疫細胞的陽性細胞率。

六、性激素水平測定

采用羅氏電化學發光儀(Cobas e601，羅氏，瑞士)檢測血清E2、孕酮(P)水平，所用配套試劑盒均購于瑞士羅氏公司。

七、統計學分析

結 果

一、患者一般資料

本項研究共納入34例研究對象，其中自然周期組19例，GnRH-ant組7例，GnRH-a組8例。3組患者間年齡、體重指數(BMI)以及取子宮內膜當天子宮內膜厚度比較均無顯著性差異(P>0.05)；GnRH-ant組與GnRH-a組的獲卵數及HCG日E2水平比較均無顯著性差異(P均>0.05)；而GnRH-ant組的HCG日P水平顯著高于GnRH-a組(P<0.05)(表1)。

表1 三組患者基本資料比較(-±s)

二、子宮內膜組織學分期

根據“NOYES(1950)時序”子宮內膜形態學分期標準[8]，對不同促排方案收集的子宮內膜進行組織形態學比較。本研究納入的3組患者的分期情況分別是：自然周期組患者(中期19例)，GnRH-ant組患者(中期7例)，GnRH-a組患者(中期7例、晚期1例)。結果顯示，與自然周期相比，GnRH-ant與GnRH-a組患者的子宮內膜分期并無顯著性差異(P>0.05)，大部分處于中期。

三、子宮內膜免疫細胞數量的變化

運用免疫組化及自動化數字分析體系對黃體中期子宮內膜各免疫細胞進行定量分析，比較GnRH-ant組、GnRH-a組及自然周期組子宮內膜各免疫細胞數量變化情況。與自然周期組比較，GnRH-ant組子宮內膜CD56+NK細胞、CD1a+樹突狀細胞及CD8+T細胞陽性細胞率顯著上升(P均<0.05)；GnRH-a組子宮內膜CD56+NK細胞，CD68+巨噬細胞顯著增加(P均<0.05)；而GnRH-ant組與GnRH-a組之間比較，各免疫細胞的數量變化無顯著性差異(P均>0.05)(表2，圖1)。

表2 三種不同促排方案間子宮內膜各免疫細胞陽性細胞率比較 (%)

A：CD56+細胞占子宮內膜總細胞的百分比；B：Foxp3+細胞占子宮內膜總細胞的百分比；C：CD163+細胞占子宮內膜總細胞的百分比；D：CD68+細胞占子宮內膜總細胞的百分比；E：CD1a+細胞占子宮內膜總細胞的百分比；F：CD8+細胞占子宮內膜總細胞的百分比。GnRH-ant組和GnRH-a組分別與自然周期組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001圖1 不同促排方案間子宮內膜各免疫細胞陽性細胞率比較

討 論

GnRH-ant是一種垂體GnRH受體的競爭性阻斷劑，它作用快速、安全，且GnRH-ant最大的好處在于不會引起類似GnRH-a造成的卵巢抑制，減少了外源性促性腺激素的劑量，從而減輕患者的經濟負擔。并且在COH過程中，選擇GnRH-ant方案，結合GnRH-a替代HCG誘發卵子成熟，能夠降低OHSS的發生率[9]。由于具有上述優勢，近年來，GnRH-ant被廣泛應用于輔助生殖技術中。

雖然有很多Meta分析比較GnRH-ant與GnRH-a方案對妊娠結局的影響，然而得出的結論不盡相同[2，10-11]。有研究認為尚不能將所有反應類型的患者合并分析GnRH-a和GnRH-ant對妊娠結局的影響。在不同反應類型患者之間，兩種方案對妊娠結局的影響可能存在差異。另有文獻報道，行GnRH-ant方案的患者，采用FET的妊娠率與GnRH-a方案無顯著性差異，而采用新鮮周期移植的妊娠率則明顯低于GnRH-a方案組，由此猜測GnRH-ant對內膜容受性可能存在不良影響[4]。小鼠實驗證明，GnRH-ant通過改變HOXA10 DNA的甲基化，抑制HOXA10的表達，從而降低子宮內膜容受性[5-6]。Ruan等[12]在小鼠實驗中，對種植窗期子宮內膜容受性標記分子進行檢測，結果發現，與GnRH-a組相比，GnRH-ant組的胚胎種植率降低，同時內膜容受性標志分子白血病抑制因子(LIF)和整合素β3的表達也相應減少。由此可見，GnRH-ant可能通過降低與胚胎種植相關的關鍵蛋白的表達，降低了子宮內膜容受性。Macklon等[13]的研究發現，與自然周期相比，GnRH-ant方案引起子宮內膜多種基因表達出現顯著變化，這些基因主要與T細胞受體信號通路、細胞黏附及信號轉導相關。然而GnRH-ant與GnRH-a方案對子宮內膜容受性影響的機制，至今仍未闡明。

胚胎的種植及早期生長發育是一個炎癥刺激過程，在這一過程中，母體子宮內膜募集大量的免疫細胞以幫助胚胎成功種植與生長，同時也要防止母體對胚胎的免疫排斥。一旦免疫細胞的數量發生異常，則會導致妊娠失敗的發生[14-15]。本研究檢測了高反應人群使用GnRH-ant和GnRH-a方案對子宮內膜各免疫細胞數量的影響，結果顯示與自然周期比較，GnRH-ant和GnRH-a方案均可顯著增加子宮內膜NK細胞數量。有研究發現NK細胞在胚胎種植、滋養細胞侵襲、血管生成及妊娠維持過程中發揮關鍵作用[16-17]。反復種植失敗及復發性流產患者子宮內膜NK細胞數量過高[18-19]。然而子宮內膜NK細胞數量過高對妊娠結局的影響仍需要多中心的臨床研究進一步證實。本研究結果顯示，與自然周期比較，高反應人群GnRH-ant和GnRH-a方案子宮內膜NK細胞的數量顯著升高。研究證實，促排過程中過高的雌孕激素可能影響子宮內膜免疫細胞的募集[20]，因此我們猜測促排過程中過高的雌激素可能促進了子宮內膜NK細胞數量的增加。而高反應人群使用GnRH-ant和GnRH-a方案后過高的NK細胞是否影響妊娠結局還需進一步探索。

同時，本研究進一步發現相較于自然周期組，GnRH-ant可上調子宮內膜未成熟樹突狀細胞和CD8+T細胞的數量，而GnRH-a組無明顯改變。研究證實子宮內膜或蛻膜樹突狀細胞參與胚胎植入、螺旋動脈重鑄和胎盤發育等諸多妊娠生理過程，它還可以通過作用于T細胞和NK細胞并調節其產生細胞因子，共同參與妊娠過程中的母胎對話。在早期妊娠建立的過程中，蛻膜樹突狀細胞直接參與了蛻膜化和胎盤的形成，條件性敲除蛻膜樹突狀細胞可導致嚴重的胚胎種植障礙，進而引起胚胎丟失[21]，而回輸樹突狀細胞可顯著降低孕鼠的胚胎吸收率[22]。同時，證據表明在母胎界面蛻膜CD8+T細胞能夠有效識別胎兒特異性抗原[23-24]。Blois等[25]在小鼠模型研究中發現，敲除CD8+T細胞可破壞孕酮的保胎作用，進一步提示其在妊娠免疫耐受調節中發揮重要作用。由此我們猜測GnRH-ant方案顯著促進了子宮內膜未成熟樹突狀細胞和CD8+T細胞數量的增加，這一現象可能破壞了子宮內膜局部免疫微環境的穩定，進而影響胚胎的種植。

綜上所述，GnRH-ant方案與GnRH-a方案相比，對子宮內膜形態學分期無顯著影響，兩種方案對子宮內膜各免疫細胞的影響也無顯著差異。但與自然周期相比，GnRH-ant方案與GnRH-a方案可顯著上調子宮內膜不同免疫細胞的數量。由于本研究采集的樣本全部來自我中心且樣本量較少，因此仍需多中心大樣本量的前瞻性研究，對GnRH-ant具體是通過何種機制影響子宮內膜各免疫細胞的數量以及是否影響妊娠結局進行深入探討。