分子標記輔助選育含有抗稻瘟病基因和軟米基因兩系不育系水稻新品系

趙國超 王冬翼 張珍 王彤 吳雪源 曾文秀 李建粵

摘 要： 以“浦軟粳S”為轉育親本，利用分子標記輔助常規育種技術成功培育出含有Pi9，Pita，Pib和Pigm稻瘟病抗性基因及軟米基因（Wxmq），同時表現柱頭外露率高的兩系不育系水稻新品系“2179S”.“2179S”不育系莖稈粗壯，矮桿大穗，株高為63.8 cm，柱頭外露率平均為60%.研究結果為今后培育具有稻瘟病抗性的優質兩系雜交水稻新組合提供不育系親本.

關鍵詞： 兩系不育系水稻; 稻瘟病抗性基因; 軟米基因; 分子標記輔助選育

中圖分類號： S 511 ?文獻標志碼： A ?文章編號： 1000-5137（2019）05-0591-06

Abstract： Using “Puruan Ging S” as the parent，we have bred new two-line male sterile rice cultivars “2179S” containing high exerted stigma phenotype as well as Pi9，Pita，Pib，and Pigm rice blast resistance genes and soft rice gene（Wxmq） by molecular marker-assisted selection.The “2179S” showed strong stalks，short stems，large panicle，and itsaverage plant height was 63.8 cm.The stigma exertion rate was about 60%.The results providing sterile line parents for developing new combination of high quality two-line hybrid rice with resistance to rice blast.

Key words： two-line male sterile rice; blast resistance gene; soft rice gene; molecular marker-assisted selection

雜交水稻產量大多高于常規培育的水稻[1].我國雜交水稻有三系法和兩系法2種類型.與三系法相比，兩系法具有配組自由、種子生產成本低、無不育細胞質負效應、易轉育新不育系等優點[2].目前，兩系法雜交水稻配套、繁殖、制種等技術都已成熟，在我國水稻生產應用上已大面積推廣.

稻瘟病是水稻種植的重要病害之一.在水稻生產中，提前使用農藥可在一定程度上降低水稻稻瘟病病害的發生，但是會傷害生態環境.在生產中使用抗稻瘟病品種是最有效的措施.通過分子標記輔助選育含有稻瘟病抗性基因的兩系不育系水稻，在我國已有一些成功報道[3-7]，這些品種都屬于秈型水稻.目前上海市水稻種植面積約有 87000 hm2，其中雜交稻種植占據了較大的比例.上海市及其周邊地區人們喜食粳型水稻，因此有必要培育適合在上海地區種植的抗稻瘟病雜交水稻.

本課題組利用分子標記輔助常規選育技術，已成功培育了高柱頭外露率軟米型的兩系不育系水稻新品系“浦軟粳S”（暫定名）.本研究將利用分子標記輔助常規育種技術進一步選育含有抗稻瘟病基因和軟米基因，同時保持高柱頭外露率的兩系不育系水稻新品系.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

使用3種水稻作為親本材料：第一個是在培育“浦軟粳S”期間，曾獲得含有柱頭外露率高并含有純合軟米基因（Wxmq）的兩系不育系中間材料“2629S”;第二個是從 “浦粳06A/42S”雜交后代中選育的高柱頭外露、稻瘟病高抗性的可育水稻“B115”，該水稻含有抗稻瘟病基因Pi9，Pita，Pib和Pigm;第三個是“浦軟粳S”.這3種水稻均由上海市浦東新區農業技術推廣中心自主選育.

1.2 軟米基因和抗稻瘟病基因鑒定

提取水稻葉片基因組DNA.按照謝米雪等[8]的報道對新選育的兩系不育系水稻進行軟米基因檢測.參考韓笑等[9]的報道，分析新選育的兩系不育系水稻的3種抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib.參考于苗苗[10]的報道，分析新選育的兩系不育系水稻抗稻瘟病基因Pigm.

1.3 育性及農藝性狀考察

采用顯微鏡觀察兩系不育系水稻花粉類型，同時通過套袋考察植株自交結實率.在兩系不育系水稻開花時進行株高、穗數、穗長、柱頭外露率等數據的考察.

2 結果與分析

2.1 選育過程及育性考察

2016年年初，以“2629S”為母本，“B115”為父本進行雜交，收獲F1種子.F1植株再自交收獲F2種子.對F2植株進行田間農藝性狀考察，用顯微鏡觀察其花粉的育性，選擇矮桿大穗、柱頭外露率高、花粉完全呈典敗類型的單株，進行分子標記檢測，篩選含有抗稻瘟病基因的植株，繼續與“浦軟粳S”兩系不育系進行持續回交三代，得到BC3F1.在每次回交前都先采用分子標記對回交親本進行抗稻瘟病基因檢測，選取含有抗稻瘟病基因的植株再進行回交.隨后在上海、海南兩地以每年2～3代的速度進行穿插加代.在對自交后代篩選中，繼續選擇矮桿大穗，柱頭外露率高，花粉完全為典敗類型的單株，進行軟米基因和抗稻瘟病基因檢測，于2018年初獲得軟米基因純合、抗稻瘟病基因純合、其他農藝性狀也基本穩定的兩系不育系水稻新品系“2179S”（圖1）.

“2179S”為光溫敏核不育系，在長日照、高溫時不育，在短日照、低溫時可育.通過分期播種進行育性觀察，“2179S”不育系均具有較長的穩定不育期，最早如4月30日播種，8月5日始穗;6月20日播種，9月10日始穗，植株均表現不育.如播期再推遲，在9月15日后始穗，植株開始轉為可育.無論在上海還是海南，在可育期植株的結實率都較低.由此推測，“2179S”不育系具有較低的育性轉換臨界溫度，育性較穩定.

2.2 軟米基因檢測

在蠟質（Wx）基因第4外顯子+693處發生堿基替換突變，將導致水稻稻米合成直鏈淀粉含量降低[11-12]，使稻米呈現軟米特征.利用謝米雪等[8]在Wx基因第4外顯子+693處突變建立檢測軟米特性的CAPS（NlaIII）分子標記操作方法，Wx基因聚合酶鏈式反應（PCR）擴增產物總長度為557 bp，含有+693位點突變的Wx基因擴增產物經內切酶NlaIII消化后，成為380 bp和177 bp 2條帶，而沒有+693位點突變的Wx基因擴增產物長度保持557 bp（圖2）.

2.3 抗稻瘟病基因鑒定

對于Pi9基因檢測，DNA擴增產物電泳后含有397 bp和291 bp 2種相對分子質量不同的條帶，其中僅僅含有291 bp條帶的為純合抗病植株，只含有397 bp條帶的為感病植株，同時含有2種條帶的為雜合植株，如圖3（a）所示.對于Pita基因，DNA擴增產物如含有467 bp條帶的為抗病植株，如圖3（b）所示.Pib基因擴增產物也有2種條帶，只含有803 bp條帶的為感病植株，只有365 bp條帶的為純合抗病植株，同時有2種條帶的為雜合植株，如圖3（c）所示.對于Pigm基因2種DNA擴增產物中，只有1800 bp條帶的為感病植株，同時有2種條帶的為雜合植株，只有750 bp條帶的為純合抗病植株，如圖3（d）所示.

2.4 農藝性狀分析

2018年8月考察新培育的兩系不育系水稻“2179S”的主要農藝性狀：植株莖稈粗壯，矮桿大穗;平均株高為 （63.8±2.2）cm，平均每穴有效穗12.0±2.1，平均穗長為 （16.4±1.1）cm，千粒重（質量）約26.0 g，平均柱頭外露率為60%.

3 討 論

改良稻瘟病抗性是當前雜交水稻育種的主要目標之一[13].在水稻生長的任何一個時期都有可能發生稻瘟病.稻瘟病防控不當有可能會造成水稻大面積減產.預防具有高產或超高產的雜交稻發生稻瘟病，對于保障水稻產量及我國糧食安全具有重要意義.

本研究涉及4個抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib和Pigm.李婷等[14]報道Pi9是已克隆的基因中抗譜最廣的抗性基因.有學者采用分子標記輔助將Pi9抗性基因導入不同恢復系水稻，均發現含有Pi9抗性基因的恢復系水稻與母本配制的雜交種對稻瘟病抗性比沒有導入Pi9抗性基因的恢復系配組的雜交種有顯著提高[15-17].王軍等[18]報道同時攜帶Pita和Pib基因這2個抗性基因可以大大提高江蘇省粳稻對穗頸瘟的抗性.廖常青等[7]將抗稻瘟病基因Pigm和Pi40分別導入兩系不育系水稻“創5S”中，檢測發現含有Pigm和Pi40基因的水稻對稻瘟病的抗性都有顯著提高，并且含有Pigm抗病基因的“創5S”水稻比含有Pi40抗性基因的水稻對于稻瘟病的綜合抗性更強.

對將Pi9抗性基因導入恢復系并與母本配組后的雜交稻種進行稻瘟病抗性研究，結果表明：Pi9抗性基因屬于顯性基因[15-17].還有一些研究也表明：水稻許多抗稻瘟病基因都屬于顯性基因[19-23].對于雜交稻而言，只要兩個親本中有一個親本具有抗稻瘟病基因，后代植株就具有抗稻瘟病特性.孟秋成等[20]在雜交稻配組實踐中也發現：當母本為抗病品種，無論配組所使用的父本品系對稻瘟病菌株表現抗、感或高感性，雜種F1代植株都表現出高抗病性.

張羽等[24]在研究抗稻瘟病基因位點數目多少與水稻品種抗病性的關系中發現：隨著水稻抗性基因位點數目的增多，品種的抗病性呈上升趨勢，由此認為稻瘟病抗性需要多個抗性基因的共同作用.本研究培育的3個兩系不育系水稻新品系正是含有多個抗性基因的類型.由此推測，今后利用本研究培育的兩系不育系水稻與恢復系制種獲得的后代植株，對稻瘟病也可能具有較強的抗性.

近年來，隨著市場對于稻米品質要求的提高，在兩系不育系水稻育種中也有一些涉及軟米選育方面的研究[25-26]，但是目前還未見進行稻瘟病抗性和米質同時改良方面的報道.本研究選育的新兩系不育系除了具有多個抗稻瘟病基因外，還含有軟米基因.今后使用這些兩系不育系配組的雜交稻種，不僅可能抵抗稻瘟病，同時商品米的口感也會較好.

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（責任編輯：顧浩然）