常溫偏酸條件下耐銅酵母的篩選及馴化

張杏艷 楊楷 黃明光 吳柱月 盧文學 何仁春 藍海恩 陳中華

摘 ? ?要：為提高動物對銅元素的吸收效率，減少糞便銅含量，降低污染及增加生物發酵料的銅營養價值，尋找能夠應用于常溫偏酸條件下進行生物發酵的富銅酵母菌。本試驗從啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae Hansen）、產朊假絲酵母（Candid autilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）三類酵母菌中選取6株菌株進行耐銅酵母的篩選，并將篩選出的耐銅酵母，模擬南方生物發酵的溫度及pH值，以逐步提高培養基初始銅濃度的方式進行馴化。結果表明，啤酒酵母的耐銅性能最佳，其最佳的銅起始馴化濃度為100 mg·L-1，經過反復馴化，其最終獲得的耐銅濃度為600 mg·L-1，經篩選耐銅啤酒酵母最適生長的銅濃度為 200 mg·L-1，在溫度為28～30 ℃，pH值 （6.2±0.2）條件下獲得的耐銅酵母風干菌體銅含量為14.97 g·kg-1。啤酒酵母經過馴化，在常溫及偏酸的條件下，能夠獲得高的耐銅特性。

關鍵詞：常溫;偏酸;銅;耐銅;酵母;篩選;馴化

中圖分類號：S963.32+7 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.012

Abstract： In order to improve the copper efficiency， reduce the copper content of excrement， decrease the pollution， increase the copper nutritional value of biological fermented feed， and get the copper-tolerant yeast which can use in fermented under room temperature and subacid condition， we picked six yeasts and screened the high efficient copper one from Saccharomyces cerevisiae Hansen， Candid autilis， Saccharomyces cerevisiae. Simulating the south fermented temperature and pH of biological fermented feed， and ?the high efficient copper yeast by increasing gradually the copper content of medium was domesticated. Result showed that Saccharomyces cerevisiae ?Hansen was screened as the highest efficient copper-tolerant yeast and the initiative domesticating copper concentration was 100 mg·L-1. After domesticating repeatedly by increasing gradually the copper content， 600 mg·L-1 was selected as the maximum copper tolerant concentration and the best tolerant culturing copper concentration was 200 mg·L-1. The copper content of dried Saccharomyces cerevisiae Hansen was 14.97 g·kg-1 under 28～30 ℃， pH （6.2±0.2）. Saccharomyces cerevisiae ?Hansen can get high copper tolerant capacity by domesticating under normal temperature， neutral leaning acid condition.

Key words： room temperature; subacid ; copper; copper-tolerant; yeasts; screening; domestication

銅元素是動物生長必需的微量元素。銅是酶的必要組分和激活劑，是維持動物生命活動和生長發育的重要營養物質，在保證動物體健康生長和高效生產方面銅元素起著非常重要的作用。銅元素通常以無機鹽的形式添加到飼料中，其中硫酸銅是使用最廣泛的銅源添加劑[1]。在實際生產過程中，動物腸胃對進入動物體內的無機礦質元素吸收力比較低，為滿足動物需求，無機銅往往添加過量，導致大量無機銅隨糞便排出體外，糞便銅含量高，影響糞便的資源化應用，大量銅元素隨糞便進入環境，造成環境污染[2]。70年代末，美國首次研制出了穩定性和動物營養有效性顯著優于無機鹽的螯合型氨基酸礦物質鹽，隨后，我國也成功研制出了這類氨基酸螯合微量元素，并用于規模化生產。蛋白質銅、氨基酸螯合銅等有機態銅是其中的產品之一， 但由于蛋白質銅、氨基酸螯合銅等有機形態的礦物質元素生產成本比較高，在實際生產中難以廣泛使用[3]。微生物可通過富集積累和生物作用，將無機態的礦質元素轉化成便于動物吸收的形態，且成本比較低，是目前獲得有機銅的優良形式。作為富集微量元素載體的微生物一般要求為對人及動物無害的有益微生物，菌體本身除對微量元素有較強富集作用之外，其本身最好還富含有蛋白質、維生素等對動物有益的活性物質，在提供微量元素來源的同時還能夠促進動物的營養吸收，增強動物的生長。酵母菌富含蛋白質、糖類、維生素和有益的活性物質，是能夠直接添加到飼料中用于生產的菌種，且對銅具有一定的耐受能力，研究表明，酵母銅的生物利用率顯著高于硫酸銅和乙酸銅[4]，是富集銅的優良菌種。酵母銅可在為動物提供有機銅的同時，促進動物的生長，此外，酵母銅能更好的與其他飼料添加劑協同配合，避免飼料營養成分的流失，且酵母銅天然具有的芳香氣味對動物胃腸無刺激作用，更有利于動物的生長[3]。

隨著畜牧業的不斷發展，對飼料的要求也越來越高。新型飼料不僅要營養價值高還要成本低，環境污染小。生物發酵料是目前畜牧業能同時滿足高營養價值和低成本要求的重要研究方向之一。研究表明，將棉籽、豆粕、全價料、玉米秸稈、象草、果皮等經過微生物發酵后可用于畜禽養殖，在提高營養利用率的同時，降低營養成本[5-10]。酵母菌是生物發酵的常用菌，以往添加的是普通酵母菌，若添加富銅酵母菌，在滿足生物發酵要求的同時還能提供有機銅，將會大大提高生物發酵料的營養價值和飼用價值。在實際生產中，南方生物發酵料的發酵及使用的條件通常為常溫、偏酸，這種條件下的生物發酵料成本最低，使用范圍最廣。這就要求酵母菌在常溫、偏酸的條件下仍具有富銅特性，但是目前適用的富銅酵母菌種較少，因此，本文主要探究常溫、偏酸條件下，酵母對銅的富集能力，尋找此條件下對銅具有高富集能力的酵母菌株，并通過馴化獲得富銅能力較高的菌株，為富銅生物發酵料的研發提供更多的選擇性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種 經文獻篩選之后，選定啤酒酵母，產朊假絲酵母，面包酵母3類酵母菌種為本次耐銅酵母菌株篩選和馴化的菌種。并根據南方生物發酵料的發酵常溫，偏酸的條件及菌種的耐銅特性在菌種保藏數據庫中進行粗篩，最后選定6株菌株為本次篩選和馴化的菌株，分別是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ?Hansen，編號為：336058，336027），產朊假絲酵母（Candid autilis （Henneberg） Lodderet Kreger-vanRij，編號為：336674，188871），面包酵母（Saccharomy ces cerevisiae，編號為：336499，340638）。菌株由北京北納創聯生物技術研究院提供。

1.1.2 培養基 固體培養基為：酵母提取物3 g·L-1，麥芽糖提取物3 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，蒸餾水，pH值為（6.2±0.2）。

液體培養基為：酵母提取物3 g·L-1，麥芽糖提取物3 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，蒸餾水，pH值為（6.2±0.2）。

1.1.3 試劑 酵母提取物，麥芽糖提取物，葡萄糖，蛋白胨，瓊脂，酒石酸，氫氧化鈉，硫酸銅。所有試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 SMART生物顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司），培英THZ-C恒溫震蕩器（蘇州培英實驗設備有限公司），LD-5電動離心機（金壇市科析儀器有限公司），立式滅菌鍋D2S2-LC100（山東新華醫療器械股份有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫療器械有限公司），血球計數板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），電感耦合等離子體發射光譜。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌種的篩選 將啤酒酵母、產朊假絲酵母、面包酵母菌種各2種菌種在無菌條件下，用接種環接種于瓊脂斜面培養基上，于28～30 ℃的溫室中培養24 h，如此反復兩代，復蘇菌種。從斜面刮取己活化的酵母菌種，接種于50 mL，pH值為（6.2±0.2）的液體種子培養基，置于28 ℃恒溫搖床，150 r·min-1震蕩培養24 h。根據菌種在液體培養基的生長狀況進行初篩，根據菌種的生長數量從中分別選3株生長良好的菌株進行銅適應性試驗。將滅菌的硫酸銅溶液添加到50 mL液體培養基中，配置成銅含量分別為0，50，100，200 mg·L-1的液體培養基，將1 mL酵母菌種子接種到液體培養基中，培養48 h，以血球計數板統計各銅濃度液體培養基中酵母菌的數量。根據單位體積內的酵母菌個數和起始培養基中銅濃度作圖，篩選出對銅適應能力較好的酵母菌和較好的銅起始馴化濃度。

1.2.2 酵母菌種的馴化 利用微生物能逐漸適應不利生長環境因素的能力，采用逐步提高培養基的中銅添加量的方式進行馴化。首先將初步篩選出來的耐銅酵母菌接種于篩選出的較好的銅起始馴化濃度的液體培養基中，本試驗篩選出的較好的銅起始馴化濃度為100 mg·L-1，置于28～32 ℃恒溫搖床，150 r·min-1震蕩培養24 h，然后從該培養物種取1 mL培養液接種到不含銅的培養基中培養24 h，如此反復培養幾代，使酵母菌在此含銅量的培養基中生長穩定。當菌體數量不再增多時，以每次提高50 mg·L-1起始銅濃度進行反復幾代的培養。用顯微鏡觀察酵母菌的形態并以干重法測量酵母菌的生長量。本試驗將起始銅濃度逐級提高到150，200，250，300，350，400，450，500，550，600 mg·L-1進行反復培養，最終使該酵母菌夠適應含銅量為600 mg·L-1的培養基環境，獲得耐銅特性。

1.2.3 耐銅酵母菌最適銅濃度的篩選 將培養24 h的耐銅酵母菌菌種1 mL接種到50 mL硫酸銅添加量分別為100，200，300，400 mg·L-1的培養基中，接種后立即取2 mL培養基保存于4 ℃下備用，再置于28～30 ℃恒溫搖床，150 r·min-1震蕩培養，培養72 h后取出，再將培養液在4 000 r·min-1離心5 min，收集2 mL上清液保存于4 ℃備用，離心得到的菌體用雙蒸水沖洗，再離心，如此反復3次，在65 ℃將菌體干燥，備用。檢測起始培養基銅濃度，上清液銅濃度，酵母菌粉含銅量。用電感耦合等離子體發射光譜測銅的含量。耐銅酵母對銅的吸附量 = 起始培養基銅濃度 - 上清液銅濃度。根據檢測結果，確定耐銅酵母的最適生長銅濃度。

1.2.4 富銅酵母制備 將馴化后的耐銅酵母菌株在上述實驗篩選出的最佳富集銅濃度下，在溫度為28～30 ℃，pH值為（6.2±0.2）的液體培養基中培養。

2 結果與分析

2.1 3種酵母菌種對起始銅適應能力的比較

將血球計數板的計數結果及培養液銅濃度作圖，由圖1可知，啤酒酵母336058的菌體數量隨培養液銅濃度的升高先升高后下降，在銅濃度為100 mg·L-1的培養液中菌體數量為5.9×108個，達到最高值，對較高濃度的銅的耐受性較高。產朊假絲酵母336674的菌體數量隨培養液銅濃度的升高波動增長，在0～50 mg·L-1較低銅濃度下，產朊假絲酵母菌的菌體數量隨培養液銅濃度的升高而下降，在50～100 mg·L-1較高銅濃度下，產朊假絲酵母菌的菌體數量隨培養液銅濃度的升高而上升，在銅濃度為100 mg·L-1的培養液中菌體數量達到較高值3.7×108個，在100～200 mg·L-1高銅濃度下，產朊假絲酵母菌的菌體數量隨培養液銅濃度的升高而下降。面包酵母菌336499的菌數隨培養液銅濃度的升高而劇烈下降。3種菌種在200 mg·L-1銅濃度下幾乎不生長，啤酒酵母336058在銅濃度為100 mg·L-1的培養中菌體數量高于產朊假絲酵母336674。因此，選定啤酒酵母336058為對銅適應能力較好的菌株，100 mg·L-1為最佳的銅起始馴化濃度。

2.2 耐銅酵母菌的耐銅特性

通過不斷提高銅濃度的反復馴化的方法，將耐銅性較好的啤酒酵母菌，以100 mg·L-1為起始銅濃度，以每次提高50 mg·L-1起始銅濃度進行馴化。由圖2可知，啤酒酵母菌在銅濃度提高到150～300 mg·L-1之間時，菌體數量穩步增長，菌體生長量較多，當銅濃度大于350 mg·L-1時菌體生長數量逐漸下降，當銅濃度提高到600 mg·L-1時，菌體數量明顯減少，因此不再提高銅濃度進行馴化。最終本試驗啤酒酵母336058獲得的耐銅濃度為600 mg·L-1。啤酒酵母菌未經馴化前，不能適應200 mg·L-1的銅濃度，經過馴化之后能夠適應600 mg·L-1的銅濃度，獲得耐銅特性。

2.3 耐銅酵母的最適生長銅濃度

由圖3A可知，耐銅酵母菌啤酒酵母336058風干菌體銅含量隨培養液銅濃度的升高而升高，對不同銅濃度下風干菌體銅含量進行方差分析表明，100 mg·L-1銅處理組與200，400，600 mg·L-1銅處理組相比，風干菌體銅含量差異極顯著（P<0.01），200 mg·L-1銅處理組與400 mg·L-1銅處理組相比，風干菌體銅含量差異顯著（P<0.05）。由圖3B可知，耐銅酵母菌啤酒酵母對銅的吸附量隨培養液銅濃度的增加先升高后下降，耐銅酵母菌啤酒酵母在銅濃度為200 mg·L-1的培養基中對銅的富集能力最強，且與其他銅濃度處理組相比達到顯著差異（P<0.05）。由圖3C可知，耐銅酵母菌啤酒酵母菌體產生量隨培養液銅濃度的升高而下降，各銅處理組之間菌體產量差異顯著（P< 0.05）。綜合分析耐銅酵母啤酒酵母對銅的富集能力，對銅吸附能力及菌體產生量，其最適生長的銅濃度為 200 mg·L-1。

2.4 富銅酵母產品的銅含量

將耐銅酵母菌啤酒酵母336058接種于銅濃度為200 mg·L-1，pH值（6.2±0.2）的培養液中，置于溫度為28～30 ℃的培養箱中，150 r·min-1震蕩培養72 h，將培養液在4 000 r·min-1離心5 min，離心得到的菌體用雙蒸水沖洗，再離心，如此反復3次，在65 ℃將菌體干燥，根據電感耦合等離子體發射光譜的檢測結果，獲得富銅酵母菌體銅含量為14.97 g·kg-1。

3 討 論

3.1 酵母菌對銅耐受性馴化機制

目前，利用微生物的生物作用來富集微量元素是國內外研究的重點。自然界中，許多微生物對銅具有耐受性，能夠從外環境中富集銅[11]。但是由于銅離子對真菌等微生物有很強的殺傷力，限制了真菌等微生物對高濃度銅離子的富集能力。僅以表1呈現的部分研究結果可見，不同細菌在不同條件下對銅的耐受能力差別很大。化學物質對微生物的抑制作用與化學物質的濃度關系密切，且隨微生物的馴化而發生變化，經過馴化后，微生物對高濃度化學物質的適應能力逐步增強[12]，利用微生物這一巨大變異潛力，可以采用人為改變微生物生活環境的方法進行誘導變異，使微生物獲得對化學物質較高的耐受性。銅是胞內多種酶代謝的激活劑，Cu2+濃度低時，可促進釀酒酵母代謝反應，但濃度進一步升高，會抑制酵母的生長活性，對酵母造成脅迫作用，嚴重影響酵母在發酵過程中的作用。因此，抗銅酵母的篩選和馴化是非常必要的。未經馴化的酵母對銅耐受能力比較弱，如工業廢棄釀酒酵母對廢水中Cu2+的耐受濃度為2.8～13.97 mg·L-1 [13]，經改良培養基可將釀酒酵母的抗銅水平提高到64 mg·L-1 [14]。而馴化則可將酵母的耐銅性大大提高。本研究選取的酵母菌未經馴化前，其對銅的耐受濃度低于200 mg·L-1，經過逐步提高銅濃度多次馴化后，其對銅的耐受濃度提高到600 mg·L-1，其對銅的耐受能力提高了3倍，這與王旭等[15]的研究結果相近，其馴化得到的釀酒酵母菌株的銅耐受銅濃度為597.19 g·g-1。因此，馴化是獲得高耐銅酵母的重要手段。

3.2 酵母菌對銅吸附能力的機制

微生物對金屬離子的富集能力主要決定于細胞壁的多孔結構和官能團，主要有胞外富集沉淀、細胞表面吸附和絡合胞內富集3種方式，其中胞外富集和胞內富集要求微生物具有活性。胞外富集是細菌在生長過程中通過釋放蛋白質和胞外多糖與溶液中的Cu2+等金屬離子形成沉淀或絡合物而將金屬離子富集[20-22]，不同的微生物釋放的蛋白質和胞外多糖組成不同，與金屬結合的性質不一樣，富集能力也不一樣，胞外富集受微生物生長條件的影響很大，且只有在溶液金屬濃度低時才可進行。細胞表面吸附是細胞表面活性基團絡合離子與金屬離子進行交換或以絡合基團為晶核進行吸附沉淀，這一過程通常迅速，受溶液pH值影響大。胞內吸附是細胞表面的酶與細胞表面吸附的金屬離子相結合而轉移到細胞內，即酶促反應，這一過程緩慢而復雜。微生物對Cu2+的吸附經歷兩個階段，一是細胞表面的絡合，在0～3 min內快速吸附Cu2+至細胞表面，二是當細胞表面Cu2+的吸附量達到總吸附量的75%時，Cu2+向細菌內部緩慢擴散[19]。研究表明，酵母菌對Cu2+表面吸附的主要部位是細胞壁，其對Cu2+的吸附量約占細胞吸附量的50%，且蛋白質的羥基基團是酵母吸附Cu2+的主要功能基團[23]。酵母菌對Cd2+的胞內吸附通過磷酸酶實現，能譜分析表明，酵母菌細胞壁上沒有Cd2+的磷酸鹽沉淀物，而細胞液泡內卻發現了大量的鎘沉淀物，磷酸酶將Cd2+運輸進酵母細胞內，并以沉淀物的形式存在液泡中[24]，酵母菌很有可能采用類似于Cd2+的運輸方式將Cu2+轉移到細胞內。本研究獲得的富銅酵母風干菌體銅含量為14.97 g·kg-1。

3.3 酵母菌對銅吸附條件的影響

微生物對金屬離子的吸附過程復雜，受pH值、吸附時間、金屬離子濃度、溫度等多種因素的影響。pH值影響生物體表面金屬吸附位點并決定金屬離子的化學狀態，pH值過高或過低都會導致生物吸附無法進行，不同的微生物對金屬離子的吸附都有一個最佳的pH值。酵母菌對銅的富集一般經過兩個過程，一是酵母菌將銅離子快速結合到細胞表面，此過程是不依賴溫度的代謝過程;二是酵母對銅離子的細胞代謝過程，此過程非常緩慢，但大量的銅離子富集依賴此過程，且受pH值的影響[25]。在pH值為2～6的范圍內，酵母對培養基中銅離子的吸收能力隨pH值的升高而升高[26]。吸附時間與微生物的種類、尺寸、形式、物理狀態、吸附的重金屬種類有關。啤酒酵母對Cu2+的吸附在1 h內就達到最大值，且在30 min內就可以完成最大吸附量的98.3%[27]。重金屬離子濃度過高會對微生物產生毒性作用而抑制吸附。溫度對微生物吸附重金屬的影響與微生物的種類有關，對某些微生物來說溫度對其重金屬的吸附影響明顯。本研究根據南方發酵條件篩選生長條件相近的菌株，在不改變原始菌株最適生長pH值、溫度、生長時間的條件下，進行耐銅酵母的馴化，獲得了良好的效果。

3.4 耐銅酵母的經濟意義和社會效益

酵母菌是南方玉米秸稈、象草、果皮等生物發酵料的常用菌。國內外對飼料添加的細菌微生物有明確的要求，只有對人對動物無害的微生物才可以作為飼料添加劑，酵母菌是其中的常用菌之一，但并不是所有的酵母菌都可以添加到飼料中。目前已經發現的酵母超過1 500種，已經被鑒定的有700多種，只有少部分能應用于飼料。根據歐盟飼料原料目錄（EU）No68/2013 中規定，只有11種酵母可在飼料中使用，其中包括釀酒酵母、產朊假絲酵母。我國飼料原料目錄2013 和飼料添加劑目錄2013 中對飼料使用的酵母菌和微量元素進行了限定，我國飼料原料和添加劑開發應用中合法使用的酵母菌和微量元素主要有釀酒酵母、產朊假絲酵母、啤酒酵母、酵母銅、酵母鐵、酵母硒等。本研究篩選用的酵母為啤酒酵母、產朊假絲酵母、面包酵母，并最終選定啤酒酵母為耐銅酵母的馴化菌種，符合國內外飼料添加微生物的要求。酵母菌同時具備良好的的發酵特性和營養特性，出于成本、實際發酵條件及動物適用的考慮，南方生物發酵料的發酵條件為常溫、偏酸，這樣成本較低，更適用于實際。為配合南方生物發酵料的發酵條件，添加的富銅酵母的適宜生長條件也應為常溫、偏酸才可能發揮出最好的發酵功能。以往，對耐銅的酵母的篩選多是以耐銅性能最高，生長溫度、pH值最適宜為標準，其目的是富集更多濃度更高的銅，并以失活的酵母銅菌劑添加到飼料中，尋求的是有機銅這一營養元素。在本研究中，我們根據南方成本較低的生物發酵條件限定溫度及pH值，模擬象草發酵的條件來篩選和馴化耐銅酵母，目的是獲得具備有發酵特性的活性富銅酵母。本研究在溫度為28～30 ℃，pH 值（6.2±0.2）的條件下，獲得了菌體含銅量為14.97 g·kg-1的活性富銅酵母菌株，該富銅酵母可作為銅元素的添加劑為動物生產提供有機銅，同時為下一步富銅生物發酵料的研發提供菌株基礎。本富銅酵母菌培養條件簡單，成本低，可降低生物發酵料的生產和研發的用菌成本，有利于畜牧業發酵飼料的發展。

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