食用菌子實體采后軟化機制的研究進展

丁樹東，李艷杰

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東淄博 255000）

食用菌（edible fungi）是食用真菌的簡稱，指那些可供人類食用的大型真菌。近年來我國食用菌產量和產值不斷增加，截至2015 年，食用菌產業已成為繼糧食、蔬菜、果樹、油料之后的第五大產業[1]。食用菌味道鮮美，營養豐富，與其他果蔬等植物性食品相比，具有蛋白質、多糖、維生素含量高，脂肪含量低的特點[2]；且食用菌還有一定的生理活性功能，如抗腫瘤[3]、免疫調節[4]和降脂保肝等作用，因此受到廣大消費者的青睞。

食用菌采后進行著許多復雜的生理變化及形態學變化，包括水分、營養物質、風味、色澤和質地的變化等。其中子實體軟化一直是食用菌采后貯藏領域討論的焦點。而細胞壁組分的降解及結構的改變被認為是導致子實體質地軟化的主要原因。本文通過綜述食用菌子實體老化過程中細胞壁組分的降解及結構的改變、細胞壁降解酶與食用菌子實體軟化的關系，探討了食用菌子實體質地軟化的機制，為進一步研究食用菌貯運、保鮮提供理論依據。

1 食用菌采后的主要生理變化

食用菌采后呼吸作用和蒸騰作用旺盛，是缺乏保護性的表皮結構，因此極易受到機械損傷和微生物侵染，造成品質下降。食用菌品質的劣變是一個復雜的、多方面生理生化變化參與的綜合過程，包括細胞壁的變化、營養物質的消耗、呼吸作用和各種代謝過程。研究表明，室溫狀態下，食用菌在3～5 d 便會出現褐變、質地變化、開傘、菇柄伸長、出現異味，在貯藏后期甚至出現自溶、腐爛等問題，這些現象大大地降低了食用菌的食用價值和商品價值。其中，質地變化是影響消費者對產品接受性的重要因素[5]，主要表現為子實體硬度下降、后熟軟化。因此，子實體軟化一直是食用菌采后貯藏領域討論的焦點。

2 食用菌采后軟化機理

目前，研究發現采后食用菌軟化的原因大致分為細胞壁代謝[6]、活性氧代謝[7]和微生物侵染[8]等方面。其中，細胞壁代謝導致的細胞壁組分的降解及結構的改變被認為是子實體質地軟化的主要原因。

2.1 細胞壁組分及結構的變化

食用菌細胞壁是一個動態的環境，具有一定的大小和強度，可以起到維持細胞形態及組織結構穩定、提供機械強度、維持滲透壓和細胞間信號介導等作用。與植物細胞壁不同，植物細胞壁以纖維素和果膠成分為主，真菌細胞壁主要是由中性多糖、幾丁質和蛋白質組成[9]，通常不含有果膠物質[10]。不同類型真菌所含細胞壁多糖類型不同，低等真菌細胞壁多糖以纖維素為主，而包含大部分食用菌在內的高等真菌細胞壁多糖則以幾丁質為主[11]。食用菌細胞壁結構獨特，由葡聚糖（主要為β-1，3 葡聚糖、β-1，6 葡聚糖、α-1，3 葡聚糖等）、幾丁質、糖蛋白和交聯蛋白組成的多層復雜組織[12]。在采后軟化過程中，食用菌細胞壁組分降解，結構發生改變，此時細胞壁聚合物的溶解度上升[13]，這導致細胞塌陷，組織結構松散，最終使食用菌質地品質下降。

2.1.1 細胞壁多糖

（1）細胞壁葡聚糖

葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，約占真菌細胞壁干質量的50%～60%[14]。真菌細胞壁中大多數葡聚糖以帶有β-1，6 分支的β-1，3-D-葡聚糖骨架為主鏈的，通過β-1，3-糖苷鍵連接形成的葡萄糖分子聚合物[15]，少部分葡聚糖是通過β-1，6、β-1，3/-1，4、β-1，4 糖苷鍵連接形成的。β-1，3 葡聚糖為螺旋狀微纖維結構，是食用菌細胞壁葡聚糖的主要成分，它可以同其他細胞壁成分共價交聯形成復雜的網狀結構，賦予細胞壁一定的彈性和張力[16]。而β-1，6 葡聚糖同樣是真菌細胞壁的重要組成成分。與β-1，3 葡聚糖相比，β-1，6 葡聚糖鏈較短，可以形成交聯的無定形結構，對釀酒酵母細胞壁基質的形成發揮重要作用[17]。Jiang 等[18]研究發現，氣調包裝處理可以顯著抑制采后香菇在軟化期間細胞壁葡聚糖含量的下降，并認為貯藏期間被降解的細胞壁葡聚糖可作為機體代謝活動碳水化合物的來源。Ni 等[19]發現，采后香菇的細胞壁葡聚糖含量隨貯藏期間延長而下降，與此同時，主要細胞壁降解相關酶的活性得到增強，編碼與細胞壁降解相關酶的主要基因的表達水平也被上調。

（2）細胞壁幾丁質

幾丁質是維持食用菌細胞壁穩定的主要結構成分，含量相對較少。它是通過β-1，4 糖苷鍵連接的由N-乙酰氨基葡糖殘基組成的線性大分子聚合物，結構與纖維素相似，具有高度結晶態且不溶于水[20]。真菌細胞壁中幾丁質最主要的存在形式為α-chitin[21]。細胞壁中的幾丁質具有高強度的氫鍵，它連接的微纖維具有很強的張力，這對于維持細胞壁的完整性和硬度具有重要的作用[22]。Zivanovic[23]、李順峰[24]、Jiang 等[18]發現貯藏期間食用菌硬度下降，但幾丁質含量不斷升高，從而使得雙孢蘑菇保持一定韌性。

（3）細胞壁纖維素

纖維素是由β-D-葡萄糖殘基通過β-1，4-糖苷鍵連接成的線性聚合物組成的，纖維素分子之間通過氫鍵進一步聚合形成含有結晶區和無定形區的微纖絲[25]。纖維素結構穩定，不易被細胞內的水解酶降解，因此其在細胞壁中起著維持細胞形狀，提高細胞壁強度的骨架作用[26]。丁樹東等[27]研究發現，外源亞精胺處理可以抑制香菇纖維素含量的下降，他認為纖維素含量與硬度呈正相關，這表明纖維素對食用菌質地起著重要的作用。

2.1.2 細胞壁蛋白

細胞壁蛋白（cell wall proteins，CWPs）同樣是真菌細胞壁的重要成分，根據功能可分為細胞壁結構蛋白和細胞壁酶蛋白。結構蛋白主要功能包括維持細胞的形態，在細胞遷移和融合時介導粘附，保護細胞免受外來物質的傷害、介導物質的吸收，以及在細胞內傳遞外界刺激誘導的信號、合成和重構細胞壁組分等[28-29]。研究表明，采后食用菌細胞壁蛋白質由于蛋白酶的作用而被降解為游離氨基酸，用于貯藏后期生理代謝活動以及幾丁質的合成[30]。

2.2 降解酶的變化

采后食用菌軟化過程中，細胞壁成分、結構變化主要是通過各種細胞壁降解酶的協同作用發生的。一般認為，食用菌細胞壁降解酶主要分為β-葡聚糖酶和幾丁質酶兩種。

2.2.1 β-葡聚糖酶

β-葡聚糖酶是指能夠降解β-1，6、β-1，3、β-1，3/-1，4、β-1，4 葡聚糖的水解酶的總稱。根據葡聚糖酶水解的糖苷鍵連接類型和對特異性底物水解作用方式，可以將β-葡聚糖酶分為外切β-葡聚糖酶和內切β-葡聚糖酶。當外切β-葡聚糖酶水解時，會從葡萄糖鏈非還原末端按順序逐個切下葡萄糖殘基，生成葡萄糖[31]；而當內切β-葡聚糖酶水解時，會在葡萄糖鏈表面任意位點隨機切開糖苷鍵，生成一些小片段的寡糖[32]。目前，對β-葡聚糖酶結構與功能的研究多集中在酵母菌[33，34]、Corallococcus sp.[35]、Bispora sp.[36]等病原菌上，而食用菌領域研究較少，下面將著重介紹外切-β-1，3 葡聚糖酶、內切-β-1，3 葡聚糖酶、內切-β-1，6 葡聚糖酶和幾丁質酶在食用菌采后貯藏中的功能。

（1）外切-β-1，3 葡聚糖酶

外切-β-1，3 葡聚糖酶是一種作用于1，3 糖苷鍵，切割葡聚糖鏈生成葡萄糖的多糖水解酶。目前已從釀酒酵母中克隆表征出3 種編碼外切-β-1，3 葡聚糖酶的基因，分別是exg1、exg2和ssg1[37]。exg1基因編碼兩種主要的胞外外切-β-1，3-葡聚糖酶[34]，exg2基因編碼附著于質膜的外切-β-1，3 葡聚糖酶[38]，ssg1基因編碼孢子形成特異性外切-β-1，3-葡聚糖酶[39]。

在擔子菌類蘑菇中，關于編碼基因的外切-β-1，3-葡聚糖酶的信息很少。Sakamoto 等[40]純化并表征了來自香菇的外切-β-1，3-葡聚糖酶，命名為exg1。exg1是歸類于GH5 家族的β-1，3-葡聚糖酶，并且與雙孢蘑菇中的外切-β-1，3-葡聚糖酶序列具有高度相似性[41]。試驗表明，exg1基因在子實體中特異性表達，但在營養菌絲體中不表達，并且在采后下調；同時，exg1編碼蛋白可降解β-1，3-葡聚糖和昆布多糖，但不降解香菇多糖。這些觀察結果表明，exg1基因不參與香菇多糖降解或子實體衰老。另一方面，exg1基因在生長的柄中顯著表達，因此，exg1可能在香菇子實體的菌柄伸長中起到了一定作用。Sakamoto 等[42]純化并表征了另一種來自GH55 家族的香菇外切-β-1，3-葡聚糖酶，命名為exg2。實驗表明，exg2在采后3 d 顯著上調，并具有很高的降解香菇多糖的能力。這些觀察結果表明，香菇中的exg2主要與收獲后的香菇多糖降解有關。與exg1基因一樣，exg2基因也在生長過程中大量表達，這表明exg2可能在菌柄伸長和子實體衰老方面具有雙重功能[42]。

（2）內切-β-1，3 葡聚糖酶

目前已從香菇中克隆表征出兩種編碼內切-β-1，3葡聚糖酶基因，即tlg1和glu1。Sakamoto 等[43]純化了一種與植物中高度保守的奇異果甜蛋白（thaumatin-like，TL）具有相似性的內切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1，并分離出與TL 蛋白具有高度相似性的編碼基因tlg1。tlg1表現出β-1，3-葡聚糖結合和β-1，3-內切葡聚糖酶活性。試驗表明，tlg1基因在香菇營養菌絲體生長的莖和新鮮子實體中的表達不顯著，然而，tlg1在采后在子實體中大量表達；同時，tlg1具有香菇多糖和細胞壁降解活性，這表明tlg1特異性參與了香菇多糖降解和子實體衰老。

隨后，Sakamoto 等[44]從采后香菇子實體中分離純化出另一種內切-β-1，3 葡聚糖酶glu1。glu1作用于昆布多糖時顯示出比對香菇多糖更高的水解活性，證明其具有顯著的底物特異性。同時，glu1與已知的β-1，3-葡聚糖酶或任何糖苷水解酶沒有顯著的相似性。此外，氨基酸序列分析顯示，glu1與任何先前描述的功能蛋白沒有顯著的同源性，該酶和其他類似蛋白被分類在新的GH 家族GH128 中。與tlg1基因相似，glu1基因在香菇營養菌絲體和新鮮子實體中的表達不顯著，但在采后子實體中大量表達，證明glu1也特異性參與了香菇多糖的降解和子實體的衰老。

（3）內切-β-1，6 葡聚糖酶

Konno 等[45]從采后香菇子實體中純化了一種屬于GH30家族的內切型β-1，6-葡聚糖氫化酶pus30a，其與灰擬鬼傘等擔子菌類物種中的β-1，6-葡聚糖酶蛋白質具有高水平的相似性。試驗表明，pus30a 基因在采后2～4 d 表達上調；pus30a 對香菇多糖無活性，但可以降解β-1，6-連接的低聚葡糖苷的細胞壁葡聚糖。這表明pus30a 在采后子實體衰老及特異性降解細胞壁多糖方面具有重要意義。

2.2.2 幾丁質酶

真菌幾丁質酶具有多重生理功能，包括降解外源幾丁質、菌絲生長過程中細胞壁重構、菌絲子實體自溶等[46]。Sakamoto 等[47]在采后香菇中鑒定出3 個編碼幾丁質降解酶的基因，即chi1、chi2和chi3，且3 個基因在采后表達顯著上調，表明幾丁質酶的表達增加在收獲后的子實體衰老中具有重要作用。另外，已經從采后子實體中克隆了編碼與幾丁質修飾有關的推定酶的其他基因，包括幾丁質脫乙酰酶（chd1）和殼聚糖酶（cho1）。據報道，采后香菇子實體中，chd1與cho1基因表達顯著上調。與此同時，chi1、chi2和cho1基因與其他擔子菌基因沒有顯著相似性，這表明與其他擔子菌相比，香菇具有獨特的幾丁質和殼聚糖代謝系統[47]。

2.2.3 細胞壁降解酶之間的相互作用

綜上所述，包括外切-β-1，3-葡聚糖酶exg2 和內切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1 和glu1 在內的細胞壁降解酶參與了收獲后的香菇多糖降解。為研究幾種細胞壁降解酶之間的相互作用，Sakamoto[6]通過使用pachyman 作為底物分析酶切得到的產物。結果表明（見圖1），內切-β-1，3-葡聚糖酶tlg1和glu1會首先縮短香菇多糖的主鏈長度，形成各種長度的寡糖；然后exg2再將寡糖進一步降解為葡萄糖和二糖；另外pus30a 會切斷部分降解的香菇多糖的側鏈[6]。因此，采后香菇子實體細胞壁降解是通過多種細胞壁降解酶的協同作用完成的。

圖1 細胞壁中香菇多糖降解機制Fig.1 Degradation mechanism of lentinan in cell wall

2.3 其他方面

活性氧代謝也是食用菌軟化的原因之一[7]。活性氧在果實采后貯藏期間不斷積累，可以與周圍分子發生反應從而引起細胞損傷、破壞核酸結構；同時，活性氧可以啟動膜脂過氧化，破壞細胞膜結構并最終促進整個機體的衰老和死亡。目前，已有研究表明，活性氧代謝在龍眼[48]、香蕉[49]等園藝作物的軟化過程中起到直接的作用。然而，活性氧代謝與食用菌軟化之間的直接關系尚未完全明確。Poovaiah 等[50]認為活性氧代謝對食用菌軟化起間接作用，他發現細胞膜的變化與軟化之間沒有關聯，但活性氧代謝誘導的細胞膜完整性的改變與子實體衰老直接存在顯著的相關性。Beelman[51]則認為，活性氧代謝誘導的細胞膜完整性喪失可能引起膜通透性的增加，進而導致細胞膨脹壓力的降低，間接地降低食用菌質地。

此外，微生物侵染對食用菌軟化也起著一定的作用。Nasiri[52]認為微生物通過分解胞內基質和減小中央液泡的體積來改變細胞結構，進而導致細胞部分結構塌陷引起軟化。而陳素芹[8]則認為，微生物活動僅可以起到加速食用菌自溶過程的作用，并不是導致雙孢蘑菇自溶軟化的直接起因。

3 食用菌軟化控制機理分析

食用菌的軟化被認為是一個多因素調控的綜合過程，需要采取適當的采后保鮮措施進行抑制。目前，傳統的氣調包裝處理[18]和化學試劑浸泡處理[53]已經廣泛用于食用菌采后品質的研究。值得注意的是，超聲波處理[54]、涂膜包裝[55]、輻照處理[56]、電解水處理[57]等非熱加工技術也逐步應用于食用菌采后生理生化的研究，這為食用菌采后品質的保持提供了新的思路與方式。

本文從食用菌子實體細胞壁組分與結構、細胞壁降解酶兩大方面對食用菌子實體軟化進行了簡要的闡述，這表明食用菌子實體采后軟化是一個多方面、多原因的綜合協同作用。然而，食用菌存在種類差異性和品種差異性，有的甚至還會存在栽培差異性，這導致食用菌種類之間、品種之間的細胞壁成分和結構存在一定的差異，無法簡單地用幾種模型作物的細胞壁成分、結構變化情況來反映所有食用菌的細胞壁降解結果及原因；另外，目前基因組測序技術的不完善，食用菌中只有少數菌種完成了測序，這意味著大多數食用菌只能從生理代謝角度來探究子實體軟化的原因，而無法進一步通過分子技術來研究各菌種子實體軟化的原因。相信隨著食用菌“育種-種植-采收-貯運”領域研究的不斷深入與分子技術的不斷發展，再輔以各種新的分析思路和分析方法，食用菌采后子實體軟化的原因一定會進一步闡明。