低劑量他克莫司導致大鼠糖耐量異常機制的初步探討

高雅莉，陳亞，李代清

移植后糖尿病（PTDM）是腎移植患者的常見并發癥［1］。移植后糖尿病的危險因素包括年齡、家族史、肥胖、免疫抑制劑的使用等［2］。他克莫司作為免疫抑制劑中的一線用藥［3］，雖能提升患者及移植物的存活率，但同時也增加了移植后糖尿病的發生風險。Porrini等［4］報告PTDM的患病率在術后3、12、24和36個月分別為27%、21%、21%和30%。如果他克莫司損傷胰島的潛在機制被闡明，就可以預防性地對可能發生移植后糖尿病的高危患者給予胰島保護措施，減少移植后糖尿病發病率。既往報道中發現，長期、大劑量在動物體內使用他克莫司，可導致胰腺組織的氧化應激、β 細胞凋亡、胰島素分泌不足，最終導致糖尿病的發生［5-6］。但實際上臨床中他克莫司使用劑量遠低于既往報道劑量（1.5 mg/kg），為進一步探索更接近于移植后患者他克莫司使用劑量對胰島功能的影響，本研究關注小劑量、短期使用他克莫司對大鼠血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性SD 大鼠20 只，體質量300～350 g，購自北京華阜康公司。動物飼養在標準環境中，自由獲取水和食物。他克莫司購自MCE公司，用橄欖油稀釋成所需濃度。血糖儀（Accu-Check，Roche Diagnostics）和配套血糖試紙購自羅氏公司。大鼠胰島素酶聯免疫吸附法（ELISA）測定試劑盒購自Mercodia 公司。Insulin 抗體購自Servicebio 公司。通用二步法檢測試劑盒、DAB染液購自北京中杉金橋生物技術有限公司。蘇木素染液購自索萊寶公司。E.Z.N.A.總RNA 分離試劑盒購于美國OMEGA 公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；定量PCR試劑盒（FAST SYBR Mixture）購自生工生物工程（上海）有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 在適應環境1周后，將20只大鼠隨機分成低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組4組，實驗組分別皮下注射0.1、0.5、1.0 mg/kg他克莫司，每日1次，連續注射1周，對照組皮下注射等劑量橄欖油。

1.2.2 體質量監測 隔天在同一時段給動物稱質量，記錄實驗期間各組動物體質量變化情況。

1.2.3 腹腔注射葡萄糖耐量試驗（IPGTT） 動物禁食過夜，采取尾尖扎血的方式測量空腹血糖，然后每只鼠腹腔注射50%葡萄糖（2 g/kg），分別以同種方法測量30、60、120 min的血糖值。由IPGTT 結果，采用梯形估算法［7］根據IPGTT 結果計算曲線下面積。

1.2.4 胰島素抵抗情況評估 在給藥1周后，尾尖取血測量空腹血糖（FBG），大鼠麻醉后股動脈取血，ELISA試劑盒檢測空腹胰島素（FINS）含量并計算穩態模型下胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。HOMA-IR=FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5。

1.2.5 胰尾部取材 大鼠過夜禁食，麻醉后四肢固定，75%乙醇皮膚消毒，沿正中切口切開，快速剪取胰尾部，置于4%多聚甲醛中固定。48 h 后，組織經過不同濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等步驟后，切片至5 μm備用。

1.2.6 免疫組化染色 用insulin 染色評估每個胰島中胰島素陽性區域。經過脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復、內源性過氧化氫消除、血清封閉后，切片用insulin（1∶500）抗體4 ℃過夜孵育，然后滴加增強復合物和二抗，根據DAB 染色程度判定胰島素蛋白的表達情況。在400放大倍數下每組隨機觀察15個胰島，通過測量胰島素染色陽性區域占總胰島面積的百分比來量化β細胞數量。

1.2.7 大鼠胰島的摘取 大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后取仰臥位將其四肢固定于手術臺上。75%乙醇消毒皮膚后，取正中切口，暴露腹腔臟器。找到膽總管，分別在十二指腸乳頭端及近肝門處予1號絲線結扎。股動脈放血處死大鼠，于膽總管近肝門處0.45 mm頭皮針穿刺，向胰腺內灌注濃度為1 g/L 膠原酶Ⅴ約10 mL，至胰腺完全膨脹，迅速分離胰腺，置于50 mL 離心管中，37 ℃水浴20～25 min 后，預冷Hank's液約35～40 mL終止消化，用力搖晃離心管，使胰腺組織成泥沙狀，靜置5 min（冰?。?，待其分層后棄上層液體，加入35～40 mL 預冷Hank's 液，洗滌2 次。混勻后取2～3 mL 消化物于平皿中，體式鏡下手工挑揀胰島，置于裝有Hank's液的1.5 mL EP管中備用。

1.2.8 qPCR檢測胰島素分泌相關基因的表達 將收集的胰島按E.Z.N.A.總RNA分離試劑盒說明書萃取總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。逆轉錄條件：25 ℃ 5 min，42 ℃1 h，72 ℃5 min。定量PCR試劑盒擴增，擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃擴增30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共40 個循環，引物序列見表1。根據qPCR 得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin為內參，用2-ΔΔCt計算結果，ΔCt=目的基因Ct 值-β-actin Ct值，ΔΔCt=低劑量組ΔCt值-對照組ΔCt值。實驗結果以對照組的倍數表示。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR表1 定量PCR引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示。他克莫司不同濃度干預組與對照組相比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。組內多個時間點間比較采用重復測量資料的方差分析。小劑量干預組與對照組間胰島素分泌相關基因表達水平比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組間體質量變化 實驗期間，對照組體質量逐漸增加，他克莫司小劑量組體質量無明顯變化，中、高劑量組呈下降趨勢。與對照組相比，不同劑量他克莫司組均出現體質量下降，且呈劑量依賴性。見表2。

2.2 腹腔內注射葡萄糖耐量試驗 IPGTT 結果顯示，120 min 內4 組血糖均呈現先升高后降低的變化，均于30 min達到峰值。與對照組相比，不同劑量他克莫司組均出現糖耐量異常，中、高劑量組血糖水平和曲線下面積均較低劑量組升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3、圖1。

Fig.1 Comparison of the area under the curve of glucose圖1 葡萄糖曲線下面積比較

2.3 胰島素抵抗水平比較 4 組間FBG、FINS 和HOMA-IR差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.4 免疫組化染色結果 低劑量組與對照組胰島β細胞形態清晰完整，染色面積無明顯變化；中、高劑量組胰島β細胞排列位置紊亂，內部出現空泡，胰島素陽性染色面積較低劑量組與對照組減少（P＜0.05），見圖2。

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4組實驗期間體質量變化 （g，n=5，±s）

Tab.2 Changes of the body mass changes during the experiments in the four groups表2 4組實驗期間體質量變化 （g，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一時間不同組間比較，a與對照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05；組內不同時間點比較，A與day 0 比較，B與day 2比較，C與day 4比較，P＜0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F day 0 331.40±3.71 334.20±4.09 335.40±3.21 337.40±4.67 2.01 day 2 360.40±8.26A 332.80±6.06a 331.00±4.00a 323.40±4.39aA 37.35＊＊day 4 372.40±6.19AB 336.20±6.12a 324.40±5.98abA 310.60±4.67abcAB 104.63＊＊day 6 384.00±8.97ABC 340.00±5.72a 321.40±8.44abAB 299.80±5.54abcABC 119.15＊＊F 50.81＊＊1.86 6.01＊＊56.36＊＊

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4組腹腔注射葡萄糖耐量試驗結果 （mmol/L，n=5，±s）

Tab.3 The results of intraperitoneal glucose tolerance test in the four groups表3 4組腹腔注射葡萄糖耐量試驗結果 （mmol/L，n=5，±s）

＊＊P＜0.01；同一時間不同組間比較，a與對照組比較，b與小劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05；組內不同時間點比較，A與0 min 比較，B與30 min比較，C與60 min比較，P＜0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F 0 min 4.72±0.34 5.00±0.58 4.98±0.54 4.96±0.15 0.45 30 min 20.58±2.11A 23.90±2.04aA 28.16±2.33abA 28.08±1.69abA 15.81＊＊60 min 10.78±1.18AB 17.14±3.45aA 20.24±2.41abAB 23.03±1.34abAB 26.50＊＊120 min 6.08±0.29BC 7.88±1.65BC 11.10±2.53abABC 12.64±1.27abABC 16.41＊＊F 170.72＊＊78.56＊＊115.61＊＊341.84＊＊

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同組間FBG、FINS、HOMA-IR變化（n=3，±s）

Tab.4 Changes in FBG,FINS and HOMA-IR of four groups表4 不同組間FBG、FINS、HOMA-IR變化（n=3，±s）

均P＞0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F FBG（mmol/L）4.50±0.31 5.03±0.50 5.37±0.42 5.17±0.15 2.79 FINS（mIU/L）5.51±1.91 4.59±1.17 4.95±1.29 5.65±1.73 0.30 HOMA-IR 1.10±0.28 1.01±0.15 1.18±0.33 1.29±0.35 0.47

Fig.2 Comparison of the insulin staining results and percentage of insulin positive area between the four groups圖2 4組胰島素染色結果和胰島素陽性面積比較

2.5 胰島素分泌相關基因檢測結果 qPCR結果顯示，與對照組相比，低劑量組Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表達量減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

Fig.3 Effects of low dose tacrolimus on gene expression of insulin secretion related protein圖3 小劑量他克莫司對胰島素分泌相關蛋白基因表達的影響

3 討論

以往研究報道多以長期大劑量使用他克莫司導致糖耐量異常為主，并未報道過小劑量短期使用他克莫司也會出現糖耐量異?，F象。本研究與既往報道相同的是，高、中劑量組均出現β 細胞數量減少，胰島素染色陽性面積減少，胰島素合成減少。大劑量他克莫司干預導致糖耐量異常的機制早在Heit等［8］的研究中曾報道，他克莫司通過抑制鈣調神經磷酸酶/活化T 細胞核因子（Cn/NFAT）通路，抑制影響 β 細胞生長和胰島素的合成。He 等［9］發現 Cn/NFAT 通路可調節肺動脈高壓模型大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移及凋亡。胰島素由胰腺β 細胞產生，葡萄糖刺激的胰島素分泌包括兩個時相，Epac在一相分泌中占主導作用，PKA 在二相分泌中占主導作用［10］。在高糖刺激條件下，cAMP 可以通過Epac途徑來促進胰島素的胞吐［11］。此外，Epac促進胰島素分泌可能與其和Rim2-Rab3a 形成的復合體有關［12］。Rim2 通過與囊泡相關蛋白 Rab3a 相互作用的囊泡對接，以及通過激活下游因子Munc13，導致反式 SNARE 復合物的組裝，從而導致胞吐［13］。Piccolo 作為胰腺細胞胞吐作用的鈣離子傳感器，Piccolo與Rim2以鈣離子依賴的方式形成異二聚體，在cAMP誘導的胞吐作用機制中發揮重要作用［14］。

血糖升高主要的原因可歸因于胰島素分泌減少和胰島素抵抗，胰島素分泌減少可由胰島素合成減少和分泌異常導致。本實驗研究結果顯示不同劑量他克莫司組的HOMA-IR 與對照組無明顯差異，說明在短時間內并未出現胰島素抵抗，所以主要考慮胰島素分泌減少的問題。低劑量組胰島素陽性面積與對照組無明顯差異，說明胰島的合成功能無異常，故主要考慮胰島分泌功能是否異常。摘取低劑量干預組大鼠胰島做分泌相關蛋白的PCR 檢測，結果表明，胰島素分泌相關基因Epac、Rim2、Piccolo、Rab3a、Munck13表達減少，小劑量短期干預組胰島素合成并無變化，主要通過胰島素分泌障礙來致使胰島素分泌減少、糖耐量異常。

本研究的發現在低于一般報道劑量（1.5 mg/kg）15 倍（0.1 mg/kg）的情況下，只需干預1 周的他克莫司便可造成糖耐量異常，這一發現超出了我們對他克莫司造成胰島損傷的一般預期。他克莫司胰島毒性是目前胰島移植臨床轉歸的障礙之一，如果其中的潛在機制被闡明，可以預防性地對可能發生移植后糖尿病的高?；颊呓o予胰島保護措施，如GLP-1等，為移植后糖尿病發生風險的降低提供新思路。